甘肅中華羊茅內生真菌形態多樣性

楊 洋，陳 娜，李春杰

(農業部草地農業生態系統學重點開放實驗室 蘭州大學草地農業科技學院, 甘肅 蘭州 730020)

禾草內生真菌是一類在植物體內度過大部分或全部生命周期，而寄主植物不顯示外部癥狀的一類真菌[1]，其依靠寄主獲得養分，寄主也因為受到內生真菌刺激而增強抗逆性[2]，宿主與植物之間有著錯綜復雜的共生關系[3]，與周圍環境之間有著密切的相互作用[4]。內生真菌作為一類新的微生物資源引起了各國科研工作者的廣泛關注。大量對禾草內生真菌共生體的研究表明，內生真菌增強了共生體的生態適應性[5]，同時能夠為植物帶來多種有益特性，如增強宿主植物抗病蟲害能力[6-7]、抗旱[8]、抗寒[9]以及促進植物生長發育[10]，提高植物產量，增強其競爭力等[11]。因此，發掘和探索新的禾草內生真菌共生體是內生真菌這一新的微生物資源有效利用的前提條件。

中華羊茅(Festucasinensis)是禾本科多年生疏叢型草本植物，為我國西北、華北、東北和青藏高原等地的常見野生牧草[12]，由于其耐寒冷，適應性強，適口性好，耐放牧，是卓越的混播用草種，現已作為高寒牧區草地生產建設的優良栽培牧草。并且中華羊茅在整個生長期內耐熱、耐旱、耐寒，許多品種具有草坪草的特征，如植株低矮、葉叢發達、春季返青早，秋季枯黃晚，耐踐踏，再生性強，抗病性強[13]，是很好的草坪建植草種，尤其在寒地型草坪群落中利用較多[14]。盡管中華羊茅感染內生真菌早已報道[15]，但其感染的內生真菌的分離培養及形態學鑒定至今仍是空白。因此對這些特性的深入研究有助于了解內生真菌在植物體內的共生機制，了解禾草-內生真菌共生體的共生特征，為內生真菌在草地農業系統中的應用提供基礎[16]。

研究表明，不同植物體內分離得到的內生真菌數量和種類不同，少則幾種，多則幾十甚至上百種[17],然而從同種植物不同個體分離到的內生真菌種類和數量也有差異。禾草內生真菌形態多樣性的相關研究有很多，但對中華羊茅內生真菌的研究報道僅見于金文進等[18]對其菌落生長的生物學與生理學特性的研究，而其多樣性的研究尚屬空白。因此，作為高寒地區的重要牧草，對其內生真菌的研究亦十分必要。

本研究通過對中華羊茅內生真菌的分離培養，從菌落形態指標和個體形態指標等方面對中華羊茅內生真菌各個菌株之間的形態多樣性作了初步探討，旨在為進一步研究中華羊茅-內生真菌共生體及內生真菌與宿主之間的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 中華羊茅成熟植株及種子于2008年9月采集自甘肅甘南的甘加草原(甘加)和桑科草原(桑科)，并將采回的種子在5 ℃條件下保存于農業部牧草與草坪草種子質量檢測中心種子貯藏室。成熟的中華羊茅植株用于進行內生真菌檢測，種子用于內生真菌的分離培養。

1.2方法

1.2.1內生真菌的檢測 參照李春杰[19]的方法，通過對400份植物樣本的種子和莖髓部的檢測，加苯胺藍染液染色，在顯微鏡下觀察生長于植物組織間的菌絲體。同時，收集帶菌植物樣本的種子用于播種，檢測4周齡幼苗的帶菌率。

1.2.2供試菌株的分離培養 將中華羊茅種子先于70%乙醇消毒5 min，再浸于6%的次氯酸鈉中消毒10 min，最后用無菌水沖洗 3次，將消毒好的種子播種于PDA培養基中，每皿20粒，置于25 ℃條件下恒溫培養。每日觀察，及時移除生長快，易被雜菌污染的種子。40 d后培養基上陸續出現生長緩慢的白色菌落，將其轉入新鮮PDA培養基中進一步純化，保種待用。分離得到的菌株在PDA平板上25 ℃培養4周，觀察菌落特征，記錄生長速度。在水瓊脂培養基中，25 ℃恒溫條件下進行產孢，3周后觀察分生孢子的著生特點，測量并記錄分生孢子及孢子梗的形態學特征。

1.2.3內生真菌的形態學鑒定和聚類分析 聚類分析是根據研究對象的特征對其進行分類的一種分析技術，將相近性質的個體分為一類，使得高度同質性的個體成為一類，則不同類間有著較高異質性。在對分離菌株進行聚類的過程中，將菌落形態、分生孢子大小、分生孢子梗長度等可甄別不同菌株的觀測指標作為統計量，根據這些指標作為聚類的依據，將相似度不同的菌株進行依次劃分，直到聚合完所有指標。采用UPGMA法進行聚類分析，建立親緣關系樹圖。在解剖鏡及顯微分析系統下觀察菌落特征和生殖器官的顯微結構，參考與分離菌株相似種的原始文獻對其進行形態學的初步鑒定，并結合宿主植物的特性，參照模式菌株的特征鑒定其分類地位。

2 結果與分析

2.1中華羊茅內生真菌的檢測與分布 在對400份植物樣品的所有地上部分的檢測中，發現帶菌率達到了98%，葉鞘、莖稈、種子里都檢測到了內生真菌的存在。在葉鞘及莖稈組織中，菌絲細長，單行，粗細均勻，分隔明顯，少分叉，呈波浪狀彎曲，平行于細胞長軸排列在細胞間隙中，未發現菌絲體穿透植物細胞或細胞層(圖1)。在種子中，菌絲體分布于糊粉粒細胞之間，菌絲粗細不均勻，分布無序，彎曲程度較高(圖2)。所有植物材料中均未見有真菌子座產生，也沒有觀察到菌絲體周圍的植物細胞有壞死、變色等癥狀。真菌菌絲體生活在宿主細胞間隙，并不破壞宿主細胞。初步認為是禾本科植物的Neotyphodium內生真菌菌絲。對采集到的野生中華羊茅樣品的葉片、葉鞘和莖稈部位的內生真菌進行分離，都能得到相應的菌株，這表明中華羊茅內生真菌在其宿主植物的各組織內普遍存在，且在植物地上部分也有著系統的分布。此外，在感染內生真菌的種子當中發現大量典型的內生真菌菌絲體，并且對帶菌樣本的種子播種后的4周齡幼苗進行檢測后發現，幼苗的帶菌率分別為90.4%和89.5%(表1)，說明中華羊茅中所帶的內生真菌能夠通過宿主植物的種子進行垂直傳播，這也證明了中華羊茅-內生真菌共生體在自然界中形成了穩定的共生體系。

表1 中華羊茅成株、種子及幼苗內生真菌帶菌率

2.2中華羊茅內生真菌的分離培養及形態學特征 本研究中的供試菌株分離自甘肅甘南主要牧區天然草地采集的中華羊茅，共得到菌株48株，在PDA培養基上25 ℃培養4周后可形成具有典型特征的菌落，獲得表型穩定的菌株，菌落特征及孢子形態見表2。

表2 分離菌株的主要形態學特征

在PDA培養基上，菌落在外觀和生長特征上均存在著一定差異。菌落顏色多為白色，少數為淺灰色；質地有的呈棉狀，有的為更加致密氈狀，有的菌落產生少量的氣生菌絲，有的則無；從菌落正面有的中心高度隆起、表面的菌褶如同腦狀，有的則緊貼培養基生長呈蠟狀。分離得到的48個菌株無論從菌落顏色、質地等表型特征，還是從孢子形態及孢子大小，都呈現出了豐富的多樣性(表2)。最終根據培養物的形態學特征，可以將分離菌株劃歸為3個形態群，聚類結果見圖3，具體形態特征描述如下：

ZHYM-Ⅰ型：25 ℃培養4周，菌落直徑為12～16 mm，生長速度緩慢。菌落正面白色，棉狀，質地緊密，中央隆起如腦狀，表面褶皺或有回溝，背面深褐色或近黑，有龜裂(圖4)。水培養4 周后,Ⅰ型菌株菌絲體可產生成熟孢子。分生孢子單個頂生，呈彎鉤形或鐮刀形，孢子平均大小(7.5～17.9)μm×(1.4～2.3) μm。菌絲基部生出分生孢子梗，直立或略彎曲，頂部較細，大小(10.5～18.1) μm×(1.3～2.1) μm，底端無隔，營養菌絲光滑透明，直徑1.0～2.1 μm (圖5)。

ZHYM-Ⅱ型：25 ℃培養4周，菌落直徑為17～23 mm，生長速度較快。菌落正面白色棉狀，質地緊密光滑，緊貼培養基生長，菌落背面褐色，有龜裂(圖4)。菌絲體水培養4周后產生成熟孢子。分生孢子單個頂生，呈半月形、舟形或腎形，孢子平均大小為(5.0～13.0) μm×(1.9～3.0) μm。分生孢子梗略彎曲，頂部較細，大小為(18.0～27.5) μm×(0.9～2.5) μm，底部無隔，營養菌絲光滑透明，直徑為0.9～2.6 μm (圖5)。

ZHYM-Ⅲ型：25 ℃培養4周，菌落直徑為15～26 mm，生長速度較快。菌落正面白色或灰白色，蠟狀，緊密光滑，菌落背面褐色(圖4)。菌絲體水培養4周后產生成熟孢子。分生孢子單個頂生，無色透明呈橢圓或腎形，孢子平均大小為(4.5～8.0)μm×(2.0～4.6) μm。分生孢子梗直立，頂端變尖，為(8.5～20.3) μm×(1.5～2.0) μm，基部無隔膜，營養菌絲光滑透明，直徑1.3～2.5 μm (圖5)。

圖3 基于形態性狀的48株內生真菌菌株聚類分析

圖4 從中華羊茅中分離出的內生真菌菌落

圖5 中華羊茅內生真菌的孢子及孢子梗形態

3 討論

本研究利用形態學的方法對從野生中華羊茅中分離出的內生真菌做了初步鑒定，48個菌株可能均屬Neotyphodium屬內生真菌，具體種的分類地位有待進一步進行系統發育學分析后加以確定。

禾本科植物內生真菌具有一定的組織特異性，只存在于植物的葉鞘、莖稈和種子糊粉層中，并且在不同部位的菌絲形態有一定的差別[20-21]。由于Neotyphodium屬內生真菌數量較多，因此其不同種的內生真菌，在菌落顏色、質地、分生孢子及分生孢子梗的形態和大小上差異明顯，能夠顯示出豐富的形態多樣性[22-23]。本研究對分離得到的所有菌株進行了植物體內分布特征、培養特性、形態學特征以及表型特征的比較，并根據這些信息進行了聚類分析。結果表明，試驗中分離得到的Neotyphodium屬內生真菌在分生孢子和孢子梗的形態和大小范圍均有變化；在菌落形態、生長速度等方面也存在差異。說明內生真菌在與植物長期的相互作用中顯示出了豐富的多樣性。金文進等[18]曾對中華羊茅內生真菌不同菌株之間，在相同溫度和pH值下，菌落生長的差異、對碳源和氮源的利用能力以及不同培養基上的產孢能力、產孢數量等方面做了研究，進一步體現了中華羊茅內生真菌的生物學與生理學特性方面的多樣性。在同種宿主植物中一般可分離到多種內生真菌菌株[24]。本研究在野生中華羊茅中共分離出3個不同形態群的內生真菌菌株，表明天然禾草中內生真菌有著較高的多樣性，體現了中華羊茅內生真菌豐富的種質資源。在內生真菌的分離過程中也發現，由于分離株間存在的基因異質性導致同一分離株的內生真菌在純化過程中會產生多個形態群，且同一形態群內的不同分離株的菌落形態也不相同。基因突變引起基因異質性，這種現象在內生真菌中廣泛存在，導致了同菌種不同分離株在形態和生物堿等代謝物的產生上有很大程度的不同[25]。菌落形態的差異同樣也是對基因異質性的反映，48株中華羊茅內生真菌菌株在PDA培養基上的形態與生長特性表現出了較高的多樣性，菌株的表型特征除了受到培養基的營養成分組成影響之外，主要決定于自身的遺傳組成特征[26]，本研究中的菌株在相同條件下表現出各異的外部特征，很可能也是其遺傳多樣性的外在表現。

[1] Siegel M R,Latch G C M,Johnson M C.Fungal endophytes of grasses[J].Annual Review of Phytopathology,1987,25:293-315.

[2] Elbersen H W,West C P.Growth and water relations of field-grown tall fescue as influenced by drought and endophytes[J].Grass and Forage Science,1996,51(4):333-342.

[3] 詹漓暉，紀燕玲，于漢壽，等． 禾本科植物內生真菌研究8——中國部分地區拂子茅屬植物Neotyphodium屬內生真菌分布及形態學特征[J]．草業科學，2009，26(1)：13-18.

[4] Clay K.Clavicipitaceous endophytes of grasses: Their potential as biocontrol agents[J].Mycological Research,1989,92(1):1-12.

[5] Clay K,Schardl C.Evolutionary origins and ecological consequences of endophyte symbiosis with grasses[J].The American Naturalist,2002,160(4):99-127.

[6] Hoveland C S.Importances and economic significance of theAcremoniumendophytes to performance of animals and grass plant[J].Agriculture,Ecosystems and Environment,1993,44:3-12.

[7] 黃東益，黃小龍，Segenet K．旗草內生真菌與旗草抗病性的研究[J]．草業學報，2009，18(2):39-45．

[8] 陳娜．醉馬草遺傳多樣性及內生真菌對其抗寒性影響[D]．蘭州：蘭州大學，2008．

[9] 李飛，李春杰．內生真菌對禾草植物抗旱性的影響[J]．草業科學，2006，23(3)：57-62．

[10] 任安芝，高玉葆．禾草類內生真菌的研究進展[J]．微生物學通報,2004，31(2)：130-133．

[11] 南志標．草坪草病害綜合防治的原則與要點[C]．北京：面向21世紀的中國草坪科學與草坪業學術討論會，1999．

[12] 師尚禮，李錦華．羊茅屬兩種牧草生態適應性及其栽培技術[J]．草地學報，2006,14(1)：39-42．

[13] 師尚禮．羊茅屬牧草的生物學特性分析及其利用[J]．草原與草坪,2000(3)：44-46．

[14] 師尚禮，李溫．羊茅屬牧草和草坪草的綜合評價[J]．甘肅農業大學學報,2000，35(2)：127-131．

[15] 南志標，李春杰．禾草內生真菌共生體在草地農業系統中的作用[J]．生態學報，2004，24(3)：605-616．

[16] 申靖，陶文文，陳昌，等．禾本科植物內生真菌研究9——Epichloyangzii的種傳特征及其在宿主體內的分布[J]．草業科學，2009，26(6)：146-151.

[17] Welty R E.Barker R E,Azevedo M D.Response of field-grown tall fescue infected byAcremoniumcoenophialumtoPucciniagraminissubsp.graminicola[J].Plant Disease,1991,75(9):883-886.

[18] 金文進,李春杰,南志標．中華羊茅內生真菌Neotyphodiumsp.生物學與生理學特性的研究[J]．菌物學報,2009,28(3):363-369．

[19] 李春杰．醉馬草內生真菌共生體生物學與生態學特性的研究[D]．蘭州：蘭州大學,2005．

[20] White J F Jr.The widespread distribution of endophytes in the Poaceae[J].Plant Disease,1987,71:340-342.

[21] White J F,Jr.，Morgan-Jones G，Morrow A C.Taxonomy,lifecycle,reproduction and detection ofAremoniumendophytes[J].Agriculture,Ecosystems and Environment,1993,44:13-37.

[22] Christensen M J,Latch G C M.Variation among isolates ofAcremoniumendophytes (A.coenophialumand possiblyA.typhinum) from tall fescue(Festucaarundinacea)[J].Mycological Research,1991,95(9):1123-1126.

[23] Christensen M J,Latch G C M,Tapper B A.Variation within isolates ofAcremoniumendophytes from perennial ryegrasses[J].Mycological Research,1991,95(8):918-923.

[24] Schulthess F M,Faeth S H.Distribution,abundances,and associations of the endophytic fungal community of Arizona fescue (Festucaarizonica)[J].Mycologia,1998,90(4):569-578.

[25] Heeswijck R,McDonald G.Acremoniumendophytes in perennial ryegrass and other pasture grasses in Australia and New Zealand[J].Austrilian Journal of Agriculture Research,1992,43(8):1683-1709.

[26] 魏宇昆,高玉葆,李川,等．內蒙古中東部草原羽茅內生真菌的遺傳多樣性[J].植物生態學報,2006,30(4):640-649．