生化湯合劑微生物限度檢查方法驗證實驗研究

(廣州市黃埔區食品藥品檢驗所，廣東 廣州 510700)

生化湯合劑是廣州市黃埔區中醫院院內制劑，該制劑由益母草、當歸、川芎、桃仁、牛膝等幾味中藥組成，具有活血逐瘀、養血止血功效，臨床主要用于產婦產后血瘀腹痛、惡露不盡等癥，療效顯著。本文按照《中國藥典》[1]2010年版要求,對生化湯合劑的微生物限度檢查方法進行了驗證試驗，并用此方法對3批該制劑進行檢驗。

1 材料與儀器

1.1 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，白色念珠菌[CMCC (B) 98001]，黑曲霉菌[CMCC(B)98003]，均為中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 培養基 pH 7.0-氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號：090703)，營養瓊脂培養基(批號:100826)，玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號：100520)，膽鹽乳糖培養基(批號：100916)，營養肉湯培養基(批號：100625)，改良馬丁培養基(批號：090202)，改良馬丁瓊脂培養基(批號：100622)，4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養基(批號:090326)，均為北京三藥科技開發公司生產。

1.3 供試品 生化湯合劑(規格：300 mL/瓶，廣州市黃埔區中醫院，批號：100514、100716、100721)。

1.4 儀器 電子天平(型號：JJ1000常熟市雙杰測試儀器廠)；自動蒸汽滅菌器(型號：CL-32L ALP Co.Ltd Tokyo Japan)；電熱恒溫培養箱(型號：HH.B11.500上海躍進醫療器械廠)；生化培養箱(型號：LRH-150B廣東省醫療器械廠)。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10 mL營養肉湯培養基中,置于30～35 ℃培養箱培養24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中,置于23～28 ℃培養箱培養48 h。上述各培養物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100 cfu/mL的菌懸液。接種黑曲霉新鮮培養物于改良馬丁瓊脂斜面培養基上，置于23～28 ℃培養箱培養7 d，加入5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫,吸取孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每含孢子數為50～100 cfu/mL的孢子懸液。

2.2 供試液的制備 取供試品10 mL，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL混勻，作為1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌、酵母菌數測定方法的驗證

2.3.1 試驗組 分別取供試液和上述制備好菌懸液各1 mL，注入無菌平皿中，立即傾注瓊脂培養基，其中加入大腸埃希菌菌液組、金黃色葡萄球菌菌液組和枯草芽孢桿菌菌液組分別傾注營養瓊脂培養基，搖勻，待凝固后倒置于培養箱,30～35 ℃培養3 d,計數；加入白色念珠菌菌液組和加入黑曲霉菌液組分別傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，搖勻，待凝固后倒置于培養箱,23～28 ℃培養5 d，計數。每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.3.2 菌液組 分別取上述各菌液1 mL，注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基培養,照試驗組方法培養與計數。

2.3.3 供試品 對照組：取1∶10供試液1 mL，注入平皿中,照試驗組方法培養與計數。

2.3.4 試驗結果 方法驗證試驗進行3次獨立的平行試驗,并分別計算各組試驗回收率。結果見表1。各次試驗試驗組的回收率均高于70%，符合規定。

表1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證結果

回收率=(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 試驗組 取1∶10供試液10 mL和制備好的大腸埃希菌菌懸液1 mL，接種至100 mL已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養基中，于35 ℃培養18～24 h。

2.4.2 供試品組 取1∶10供試液10 mL，接種至100 mL 已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養基中，于35 ℃培養18～24 h。

2.4.3 陰性菌對照組 取1∶10供試液10 mL和制備好的金黃色葡萄球菌菌懸液1 mL，接種至100 mL已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養基中，于35 ℃培養18～24 h。

2.4.4 陰性對照組 取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL，接種至100 mL已滅菌的膽鹽乳糖增菌培養基中，于35 ℃培養18～24 h。

2.4.5 取上述各組培養物0.2 mL，分別接種至各含5 mL MUG培養基的試管內，置于35 ℃培養箱培養，培養物分別于5、24 h置365 nm紫外燈下觀察，觀察結果后，沿各培養管管壁分別加入數滴靛基質試液，觀察結果。

2.4.6 結果判斷 方法驗證試驗進行3 次獨立的平行試驗，結果見表2。試驗組檢出大腸埃希菌，供試品組、陰性菌對照組、陰性對照組均未檢出大腸埃希菌，陰性菌對照組未檢出陰性菌。

3 討論

細菌、霉菌及酵母菌方法驗證試驗結果表明，生化湯合劑中的各中藥成分無抑菌作用，可采用平皿法對其進行細菌、霉菌及酵母菌微生物限度檢測方法檢測。控制菌方法驗證結果表明，采用常規法檢查大腸埃希菌方法有專屬性，不受其他菌的干擾。

《中國藥典》2010年版規定當建立藥品的微生物限度檢查法時，需進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法的驗證,以確認所采用方法適合于該藥品的檢查[2]。當藥物的生產方法變更、制劑組分發生改變、檢查法修訂或檢驗條件發生改變時,檢查方法也應重新進行驗證，尤其是中成藥制劑,而不同藥品的微生物驗證方法不盡相同,故方法的設計至關重要[3]。本文介紹的微生物驗證方法為中藥制劑的微生物檢查的驗證提供了參考。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010:附錄107-116.

[2]鄭繼明,朱婕妤.理氣解郁合劑微生物限度檢查方法驗證[J].海峽藥學,2010,22(10):75-77.

[3]湯大妹,汪健,趙勤,等.參味合劑微生物限度檢查方法的驗證[J].實用臨床醫藥雜志,2010,14(1):69-70.