EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶在非小細胞肺癌中高甲基化失活

鐵 茹， 胡 浩， 谷仲平， 曲 萍， 于 軍， 陳寶瑩 (第四軍醫大學基礎部教學實驗中心， 西安 700;唐都醫院胸腔外科;唐都醫院放射科;通訊作者，E-mail:yujunby@fmmu.edu.cn)

肺癌是癌癥患者的常見死因，而非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是其中最常見的病理學類型［1，2］。遠處轉移是NSCLC引起死亡的最常見原因，在此過程中受體型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)發揮重要的作用［3，4］。促紅細胞生成素產生肝細胞激酶(erythropoietin-producing hepatocyte kinase，EPH)受體是RTK家族中最大的亞家族，到目前為止，已在動物中發現有16個EPH 成員［5，6］。EPH 受體與 ephrin配體相互作用。EPH受體分為兩類:EPHA(包括 EPHA1-10)和EPHB(包括EPHB1-6)，這兩類受體分別與各自的配體結合發揮作用。EPH受體與其配體結合之后產生一系列生物學效應，包括細胞間相互作用和細胞遷移［7，8］。EPHB6 作為 EPHB 受體之一，它的表達失活與人類多種腫瘤的發生和轉移有關［9-15］。有文獻報道，在神經母細胞瘤患者中，EPHB6的表達提示預后較好［9-11］。另外，在轉移性黑色素瘤和具有轉移潛能的浸潤性乳腺癌細胞中，都發現EPHB6表達下降［13-15］。與正常肺組織相比，A549 NSCLC細胞系低水平表達 EPHB6［16］，為此，我們選擇A549細胞作為主要模型研究EPHB6表達失活的機制。

1 材料和方法

1.1 臨床材料 收集2007-08～2010-07醫院門診正常肺組織患者9例，以及診斷為非小細胞肺癌(NSCLC)患者78例，其中未發生轉移的NSCLC患者39例和發生轉移的NSCLC 39例。

1.2 實驗材料 Dulbecco’s Modified Eagle’s培養基(DMEM，Invitrogen公司，美國)，10%的胎牛血清(FCS)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，A549肺腺癌細胞，5-氮-2'-脫氧胞苷(Sigma，MO，USA)，反轉錄試劑盒(Promega，Madison，Wisconsin，USA)，限制性內切酶 Sma Ⅰ(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，DNAzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，EZ DNA Methylation-Gold TM Kit試劑盒(Zymo research Corp.，Orange，CA，USA)，TOPO TA 克隆測序試劑盒(Invitrogen 公司)，兔抗人 EPHB6(1 μg/ml，Santa Cruz，USA)，RNA(Invit Promega，Madison，Wisconsin，USA rogen，Carlsbad，CA，USA)，ERK(1∶1 000 稀釋，Cell Signaling Technology，USA)，小鼠抗人 β-actin(40 ng/ml，sigma，USA)，化學發光法(ECL Plus，Amersham Pharmacia，Sweden)顯色。

1.3 方法 實驗分為三組:正常肺組織組(正常組)、未發生轉移的NSCLC腫瘤組織組(對照組)、發生轉移的NSCLC腫瘤組織組(病例組)。

1.3.1 細胞培養 A549肺腺癌細胞培養采用改良Dulbecco’s Modified Eagle’s培養基，含10%的胎牛血清(FCS)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，于37℃、5%CO2的孵箱中培養。1.3.2 患者標本 主要的腫瘤標本和正常的肺組織取自NSCLC外科手術，將標本置于液氮中冷凍，保存于-80℃冰箱，采用組織學方法檢查腫瘤標本的腫瘤細胞百分比，僅將含有70%腫瘤細胞的活體腫瘤組織用于后續的mRNA和蛋白質的表達分析及隨后的DNA甲基化分析。為了排除個體間的差異對實驗結果的影響，還比較了另外24例NSCLC患者的成對的腫瘤組織和正常肺組織中EPHB6的mRNA表達水平。

1.3.3 5-氮-2'-脫氧胞苷處理 A549細胞用由1 mmol純水原液配置的100 μmol/L的5-氮-2'-脫氧胞苷處理。細胞每48 h補充一次新鮮培養液和5-氮-2'-脫氧胞苷，生長2-6 d。

1.3.4 RNA提取和逆轉錄 RIzol試劑分離總RNA，以1 μg RNA為模板，采用反轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。

1.3.5 實時定量RT-PCR測定基因表達水平 為了觀察患者EPHB6的DNA甲基化水平，采用了甲基化敏感的SmaⅠ限制性內切酶進行研究。采用實時定量RT-PCR法對臨床Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織的 EPHB6表達水平進行測定。用DNAzol(提取試劑)從每一個樣本中提取1 μg基因組 DNA，等分為兩份，每份0.5 μg，用甲基化敏感性限制性內切酶SmaⅠ消化，或者用限制性內切酶的緩沖液假消化作為對照。通過實時定量PCR用以下引物和探針對消化或假消化DNA進行分析:正向引物5'-CGGGCCCCCAGGATCTC，反向引物5'-TGCCACCCGCGTCTTCTC，探針 5'-FAM-CGGCGCCGAACGGACCCG-TAMRA。探針位于甲基化敏感的SmaⅠ位點。甲基化水平的計算公式如下:甲基化水平 =2ΔCT，ΔCT=CTT-CTN(T:處理的SmaⅠ;N:未處理的SmaⅠ)。

1.3.6 亞硫酸氫鹽測序法檢測啟動子區域與CpG島甲基化水平 為了研究NSCLC中EPHB6基因被抑制的機制，需要測定了EPHB6啟動子的甲基化水平。選擇了1例腫瘤組織中EPHB6表達水平較正常肺組織顯著降低的NSCLC患者為研究對象，采用亞硫酸氫鹽測序法檢測EPHB6基因的啟動子和第一個內含子區。用DNAzol提取基因組DNA，然后按照說明書用亞硫酸氫鹽與EZ DNA Methylation-Gold TM Kit試劑盒處理。利用Methyl Primers Express version 1.0(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)設計的引物進行PCR。啟動子區域的甲基化水平的分析基于以下引物:5'-GGGTTGCGTTCGTTTTAGTC-3'(正向)和5'-CGCCGAAAATCCCTAAAATT-3'(反向)。內含子區域的引物是5'-AGTTAGATTGGGGGTAGAGTAG-3'(正向)和5'-ATCTAACCAAACAACCACTTAA-3'(反向)。用TOPO TA克隆測序試劑盒克隆PCR產物。用至少9個帶有正常或腫瘤組織的EPHB6啟動子或內含子區的克隆用于篩選和測序。

1.3.7 Western blot檢測 用冰凍的 PBS沖洗細胞，加入含150 mmol NaCl的冰冷RIPA緩沖液，冰上裂解30 min。20 000×g、4℃離心10 min內清除細胞裂解物。調整蛋白質濃度后，在SDS上樣緩沖液中以95℃加熱細胞裂解物10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE，4%，Invitrogen公司)以分離蛋白，轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。蛋白檢測:一抗，兔抗人EPHB6，兔抗人磷酸化或總ERK，小鼠抗人β-actin。采用辣根過氧化物酶(HRP)耦聯二抗，化學發光法顯色。

2 結果

2.1 NSCLC中EPHB6表達缺失 EPHB6表達水平的測定的結果見圖1。與對照組相比，腫瘤組織中EPHB6 mRNA水平降低，最低者出現在手術治療后發生轉移的患者腫瘤組織中(P＜0.05，見圖1A)。另外24例NSCLC患者的腫瘤組織和正常肺組織患者中13例的EPHB6 mRNA表達水平降低(圖1B)。另外，Western blot分析顯示NSCLC腫瘤組織中的EPHB6蛋白水平降低(圖1C)。

圖1 EPHB6表達水平的測定Fig 1 Expression of EPHB6 in different groups

2.2 NSCLC中EPHB6高甲基化 實時定量RTPCR測定基因表達水平結果見圖2所示。序列分析結果表明，EPHB6的啟動子區富含CpG二聯體(圖2A)，與正常肺組織相比，腫瘤樣本的啟動子區及第一內含子區有6處CpG島的核苷酸甲基化水平的升高(圖2B)，而NSCLC患者的樣本相對于正常肺組織顯示了較高水平的甲基化(P＜0.05，見圖2C)。EPHB6基因甲基化水平升高的腫瘤樣本EPHB6 mRNA的轉錄水平降低(r=-0.55，P＜0.05，見圖2D)。基因甲基化水平高的腫瘤組織EPHB6的轉錄水平低(P＜0.05，見圖2E)。

在mRNA水平和蛋白質水平上，A549細胞的EPHB6基因表達顯著上升(圖3A、B)，而EPHB6甲基化程度下降(圖3C)。

3 討論

本研究綜合運用基于甲基化敏感的SmaⅠ限制性內切酶的實時定量RT-PCR實驗、亞硫酸氫鹽測序實驗和5-氮-2'-脫氧胞苷誘導基因重新表達等實驗技術，發現在NSCLC中EPHB6基因啟動子發生了較為廣泛的甲基化。EPHB6基因啟動子區的高甲基化與NSCLC中EPHB6 mRNA和蛋白質水平的下調密切相關。EPHB6表達缺失與NSCLC患者早期發生轉移的風險升高相關。從而，首次闡明了NSCLC中EPHB6表達失活的機制。

文獻報道乳腺癌中EPHB6啟動子區域的CpG島呈高甲基化狀態［13］。另外，還發現EPHB6基因第一個內含子中的甲基化水平存在組織差異［17］。在SmaⅠ限制性內切酶處理后，對照組的肺組織酶切片段擴增水平顯著下降，而腫瘤樣本的酶切片段擴增水平不變，從而進一步證實了上述硫酸亞氫鹽測序實驗的結果。我們對14例NSCLC患者的研究發現，NSCLC樣本相對于正常肺組織顯示了較高水平的甲基化，而EPHB6基因甲基化水平升高的腫瘤樣本EPHB6 mRNA轉錄水平降低的數據顯示甲基化和低表達有顯著的相關性，同時基因甲基化水平高的腫瘤組織EPHB6的轉錄水平降低。通過對經過去甲基化試劑5-氮-2'-脫氧胞苷處理的A549細胞的EPHB6的表達水平進行測定結果發現，在mRNA水平和蛋白質水平上，EPHB6基因的表達都顯著上升，這種表達上升與EPHB6的甲基化程度下降有關。

圖2 實時定量RT-PCR測定基因表達水平Fig 2 Gene expression levels in NSCLC by RT-PCR

圖3 Aza處理后EPHB6 mRNA水平及其甲基化的變化Fig 3 Changes of EPHB6 mRNA and methylation in NSCLC after Aza treatment

基因的活性受到遺傳因素和表觀遺傳因素的雙重調節。表觀遺傳(epigenetic)因素雖然不改變DNA序列，但可以通過對DNA的修飾而降低相關基因的轉錄活性［18］。表觀遺傳因素可以導致EPHB6“量”的變化，即EPHB6表達水平的降低會導致缺乏足夠數量的分子來維持其正常的功能。目前已經明確，腫瘤的轉移與多種癌基因的低甲基化過表達以及抑癌基因的高甲基化失活有關，甲基化導致基因沉默的頻率高于突變、缺失等造成的基因沉默［19，20］。DNA序列中的 CpG 二聯體是甲基化的靶點，DNA甲基轉移酶(DNA methyl transferase，DNMT)以CpG二聯體中的C為底物，將S腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基轉移到 C上，形成甲基化的mCpG。一些DNMT抑制劑被用于逆轉抑癌基因的甲基化。CpG二聯體以較大的密度分布于基因5'端，稱為CpG島。CpG島一般為0.5-2 kb長，通常位于基因的5'端啟動子區，也可延伸至外顯子區，CpG島的高甲基化將抑制該基因轉錄［23］。文獻報道在多種人類腫瘤中 EPHB6 表達均被抑制［13，15，22］，而EPHB6在乳腺癌細胞系中的轉錄失活是啟動子區DNA高甲基化造成的［15］，從而表明EPHB6的高甲基化沉默可能在多種類型腫瘤當中都會發生。

綜上所述，NSCLC中EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶因啟動子區高甲基化而沉默，EPHB6的失活與NSCLC的轉移密切相關，提示通過降低EPHB6啟動子DNA的甲基化水平激活其表達，有可能為預防NSCLC發生轉移提供新的方法。

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