熱休克蛋白70對LPS誘導的急性肝損傷的影響

牛 利， 許瑞齡 (山西醫科大學病理生理學教研室， 太原 030001)

在各型急慢性肝損傷、酒精性肝病及急性肝衰竭過程中TNF-α作為炎性細胞因子扮演了重要的角色，臨床實踐中發現重型肝炎患者血清TNF-α水平明顯升高［1］。TNF-α是引起肝損傷的重要促炎細胞因子，可由LPS誘導枯否細胞產生，在急性肝損傷發病過程中起著非常重要的作用。近年來，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)在適應性細胞保護中的作用日益受到重視。據報道，亞砷酸鈉(sodium arsenite，SA)可誘導肝臟產生熱休克反應，使組織和細胞處于應激狀態，導致熱休克蛋白特別是HSP70的產生［2］。細胞受到輕度刺激后，HSP70可在轉錄和翻譯水平調整相關蛋白的合成，改變細胞的代謝和功能，以減輕有害刺激所致的損傷。為此本實驗利用腹腔注射SA誘導肝臟HSP70表達，通過HSP70對肝損傷中TNF-α的影響來探討HSP70保護肝臟的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物，試劑及儀器 雄性昆明種小鼠70只，體重(25±2.9)g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。內毒素(LPS)購自Sigma公司;亞砷酸鈉:購自湖南水口山礦務局衡陽實業總公司;TNF-α放免試劑盒:購自北京解放軍總醫院;Re-24型SORALL低溫超速離心機:美國Du Pont公司;TNF-α和HSP70羊抗鼠多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;辣根過氧化酶標記的兔抗羊二抗購自北京中杉生物技術公司。Marker購自美國 Amershammacio Biotch公司;PVDF膜購自美國Milipore公司。DYY-Ⅲ8B型穩壓穩流定時電泳儀、DYY-Ⅲ7B型轉移電泳儀:北京六一儀器廠。UV-2102型分光光度計:尼龍柯(上海)儀器有限公司。

1.2 動物分組和處理 雄性昆明種小鼠70只，習服飼養5 d，實驗前1 d下午禁食，飲水不限，將小鼠隨機分為:對照組(n=10)，0.9%NaCl 0.2 ml/只腹腔注射;LPS組(n=30)，LPS溶于生理鹽水，劑量為5 mg/kg，腹腔注射一次;SA預處理組(n=30)，SA溶于無菌生理鹽水，8 mg/kg于前一晚8:00腹腔注射一次，12 h后腹腔注射LPS，劑量和處理與LPS組相同。各組動物分別于處理后0.5 h(n=10)、1.5 h(n=10)、6 h(n=10)，在戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉下經眼內眥靜脈采血、開腹取肝。肝組織用鋁薄紙包裝，液氮速凍后－70℃冰箱冷凍保存。

1.3 方法 用Western blot方法檢測肝臟HSP70，TNF-α蛋白的表達;按照改良金氏法測定血漿ALT活性;用放射免疫法測定肝勻漿中TNF-α的含量。1.3.1 各組取凍存的肝組織200 mg，置液氮研碎，轉入勻漿器中加入RIPA(用前加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)裂解液后勻漿，12 500×g，4℃離心20 min，取上清。肝組織細胞核蛋白按Essani方法提取。Bradford法測定蛋白含量。取等量蛋白(20 μg)加樣，以4%濃縮膠，10%分離膠(測HSP70)和15%分離膠(測 TNF-α)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)補充其濃度。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉印跡至PVDF膜，轉膜過夜后經5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，1×TBST緩沖液漂洗(3次，10 min/次)，然后分別加入1∶1 000的相應蛋白抗體，4℃搖蕩過夜。次日用1×TBST漂洗3次后，再加入1∶2 000的針對一抗種屬的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下搖蕩2 h，1×TBST漂洗3次。然后在暗室內將膜置入ECL發光液1－2 min，用PE保鮮膜包蓋PVDF膜，置于X線膠片下曝光、顯影和定影。將定影后的X線片圖像用掃描儀轉化為數碼圖像，用 Quantity One(Bio-Rad)4.52軟件，進行圖像分析處理，獲取圖像光密度值(A)。

1.3.2 取6 h的內眥靜脈血液離心后取血清100 μl，加入谷丙基質液 0.5 ml，置于37 ℃水浴30 min，后每管加入2，4－二硝基甲苯0.5 ml，37℃水浴20 min 加入 0.4 mol/L NaOH 5.0 ml混勻于520 nm 光電比色。

1.3.3 取凍存的1.5 h的肝組織100 mg加入 pH 7.4的磷酸鹽緩沖液1 ml，勻漿機上攪碎。按TNF-α試劑盒說明書測定肝勻漿中TNF-α含量。

1.4 統計學分析 使用SPSS11.5統計軟件，數值均以±s表示。One-way ANOVA進行多樣本均數的比較，當P＜0.05時，采用LSD-t檢驗進行均數的兩兩比較(α =0.05)。

2 結果

LPS注射后0.5 h肝臟HSP70達到表達高峰，隨著時間推移其表達逐漸減弱;而經SA預處理動物肝臟HSP70表達在上述3個時間點均較LPS組明顯增強(P ＜0.05，見圖 1、表1)。LPS組 TNF-α表達在3個時間點較對照組明顯升高，而經SA預處理動物肝臟TNF-α表達在0.5 h和1.5 h雖較對照組高，但較LPS組明顯減少(P＜0.05，見圖2和表1)。SA預處理 TNF-α在6 h仍較 LPS組減少，其差異具有統計學意義(P＜0.05，見圖2和表1)。

圖1 小鼠肝臟HSP70的Western blot分析Fig 1 The expression of HSP70 in the liver of mice by Western blot

圖2 小鼠肝臟TNF-α的Western blot分析Fig 2 The expression of TNF-α in the liver of mice by Western blot

表1 小鼠肝臟HSP70，TNF-α在不同肝損傷時間的表達結果Tab 1 The expression of HSP70 and TNF-α in the liver of mice at different time points after LPS-induced hepatic injury

LPS所致肝損傷組血漿ALT活性較對照組顯著升高(P＜0.01)，而SA預處理組的ALT活性明顯低于肝損傷組，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。肝損傷組TNF-α水平明顯高于對照組(P＜0.05)，SA組TNF-α水平雖高于對照組但卻明顯低于肝損傷組，差異具有統計學意義(P＜0.05，見表2)。

表2 各組ALT，TNF-α的含量比較Tab 2 The contents of ALT and TNF-α in different groups at 6 h

3 討論

HSP是生物體在不利環境因素刺激下應激合成的一組特殊的蛋白質。它可以使細胞進入保護狀態，特別是HSP70的產生可使細胞對致死性的損傷產生抵抗。誘導型HSP70的主要功能是發揮分子伴侶作用［3］及調控炎癥因子釋放作用［4］，可以保護細胞線粒體免遭活性氧化產物的攻擊、抑制促炎癥因子如TNF-α、IL-1等誘導的呼吸爆發［5］。細胞受到輕度刺激后，HSP70可在轉錄和翻譯水平調整相關蛋白的合成，改變細胞的代謝和功能，以減輕有害刺激所致的損傷，HSP70參與此項調節過程，并可增強細胞對損害的耐受力。本實驗用SA預處理誘導HSP70的合成來抵御LPS誘導的肝損傷。實驗結果表明SA 預處理組HSP的含量在0.5 h，1.5 h，6 h三個時間點都明顯高于LPS組(P＜0.05)，說明SA預處理可增加HSP70的表達。在急性肝損傷時，血漿ALT水平的升高在2 h后12 h前［6］，因此本實驗選擇測定肝損傷后6 h血漿ALT的水平。結果顯示，肝損傷組ALT明顯高于對照組及SA預處理組，說明增加HSP70的表達對肝損傷具有保護意義。

腫瘤壞死因子是具有多種生物活性的多肽調節因子，適量的TNF-α可調節機體的免疫功能，對維持機體的正常穩定狀態及抵御各種致病因子有著重要的作用。而TNF-α的異常分泌又可作為機體炎癥、損傷和休克的重要炎性介質，參與誘導細胞的凋亡過程。肝臟富含TNF-α受體，且具有高親和力，是TNF-α的重要靶點，對TNF-α的毒性具有高度敏感性，它與肝臟炎癥活動性及肝細胞壞死程度密切相關［7］。TNF-α可通過激活磷酯酶 A，引起炎細胞的聚集、滲出和浸潤，產生嚴重的炎性損傷;也可誘導肝細胞產生自由基和脂質過氧化反應;另外，它還可通過誘導中性粒細胞和單核巨噬細胞的活化，產生更多的氧自由基，形成惡性循環，加重肝損傷。熱應激或亞砷酸鹽預處理肺泡巨噬細胞，可明顯減少巨噬細胞受LPS刺激后分泌的TNF-α水平，而且可能是通過誘導HSP70以翻譯水平來調節LPS刺激肺泡巨噬細胞分泌的 TNF-α［8］。本實驗在 0.5 h，1.5 h，6 h三個時間點SA預處理組TNF-α的水平均顯著低于損傷組(P＜0.05);而急性肝損傷時，TNF-α的分泌高峰在1 h后［6］，因此本文選擇測定損傷后1.5 h肝勻漿中TNF-α的含量，結果顯示，肝損傷組TNF-α的含量明顯高于對照組，而SA預處理組肝勻漿TNF-α水平明顯低于肝損傷組(P＜0.05)，提示SA誘導肝臟HSP70表達可減少肝損傷中TNF-α的釋放，以減輕TNF-α對肝臟的損傷作用。

綜上所述，SA預處理可誘導肝臟產生HSP70，在LPS誘導的急性肝損傷中，可通過降低TNF-α的含量來達到減輕肝臟炎癥反應，減弱肝損傷的程度。

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