高效液相色譜法測定金葉接骨木中熊果酸和齊墩果酸的含量

趙淑紅， 高亦瓏， 馬學琴， 楊美玲 (寧夏醫科大學高職學院， 銀川 750004;寧夏醫科大學藥學院)

金葉接骨木(Sambucus canadensis.Aurea)為忍冬科接骨木屬植物加拿大接骨木(Sambucus Canadensis L.)的彩色葉變種，我區作為觀賞植物從外地引進并在銀川地區栽培［1］。接骨木屬植物有著廣泛的臨床藥用價值，其中齊墩果酸、熊果酸是接骨木屬植物抗病毒性肝炎活性成分，臨床用于治療急性病毒性肝炎療效顯著［2］。本人在前期的實驗中檢測出金葉接骨木的莖葉中含有槲皮素、蕓香苷以及熊果酸、齊墩果酸等化學成分［3］。金葉接骨木如接骨木屬其他植物一樣具有一定藥用價值，本文對銀川地區引種的3年生金葉接骨木莖葉中齊墩果酸和熊果酸2種成分進行含量測定，并建立高效液相色譜法測定金葉接骨木中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，為進一步開發和利用其植物提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日立 L2000高效液相色譜儀(L-2455DAD)檢測器，L-2300柱溫箱，L-2200自動進樣器，L-2130四元泵，分析天平(AP210，1/10萬)，超聲波提取器(KQ-500B)，中藥材粉碎機(FW100型)。

1.2 試藥 齊墩果酸對照品(批號110742－200314，中國藥品生物制品檢定所);熊果酸對照品(批號8502，中國藥品生物制品檢定所);甲醇(色譜純，美國TEDIA天地試劑公司);乙腈(色譜純，美國TEDIA天地試劑公司);娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:美國 Thermo ODS-2HYPERSIL(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－0.4%磷酸水溶液(80%∶20%);檢測波長:210 nm，流速0.8 ml/min，柱溫:25 ℃。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱量熊果酸對照品5.0 mg、齊墩果酸對照品 1.3 mg，共同置 5 ml容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容，得熊果酸、齊墩果酸混合對照品溶液，臨用前稀釋［4，5］。在 2.1 項所述色譜條件下，取對照品溶液進樣10 μl檢測，理論塔板數為5 000，齊墩果酸和熊果酸分離度為1.6，得色譜圖1。

圖1 齊墩果酸、熊果酸對照品HPLC色譜圖Fig 1 High performance liquid chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid

結果顯示，齊墩果酸色譜峰保留時間為28.00 min，熊果酸色譜峰保留時間在29.59 min，兩者能夠基線分離。

2.3 供試品溶液的制備 分別取金葉接骨木的葉和莖藥材，粉碎，過80目篩，60℃干燥至恒重。分別精密稱取適量(相當生藥0.5 g)，置200 ml具塞三角錐形瓶中，加入甲醇10 ml，超聲提取40 min，冷卻，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中得金葉接骨木葉和莖藥材供試品溶液。

2.4 線性范圍考察 取稀釋后的齊墩果酸、熊果酸混合對照品溶液(齊墩果酸、熊果酸濃度分別為243.36 μg/ml，64.92 μg/ml)，分別稀釋1.5，2，3，4，10，20倍后按2.1項下色譜條件進樣檢測，以峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標進行線性回歸。從標準曲線圖中測得齊墩果酸回歸方程C=0.000 1A+3.440 5，r=0.999 9，表明齊墩果酸在 12.17 －243.36 μg/ml濃度范圍內線性關系良好;熊果酸回歸方程 C=4 ×10－5A+0.979 1，r=0.999 8，表明熊果酸在3.25 －64.92 μg/ml濃度范圍內線性關系良好。

2.5 穩定性試驗 取同一金葉接骨木葉供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 進樣測定，考察其穩定性。記錄峰面積，計算齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為0.63%和0.81%。表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.6 精密度試驗 取同一金葉接骨木葉供試品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，計算齊墩果酸和熊果酸峰面積的 RSD，RSD分別為1.05%和0.73%(n=6)。表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 精密稱定同一批金葉接骨木葉樣品，按2.2項下方法分別制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，分別按回歸方程計算齊墩果酸和熊果酸的含量。其RSD值分別為0.85%和1.42%(n=6)，表明此方法重復性良好。

2.8 加樣回收率 稱取已知含量的金葉接骨木葉樣品6份，每份約0.5 g，準確計算樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量，分別加入適量齊墩果酸和熊果酸對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，進樣，結果見表1。

表1 齊墩果酸和熊果酸加樣回收率的試驗結果 (mg，n=6)Tab 1 The recovery results of oleanolic acid and ursolic acid (mg，n=6)

結果顯示，齊墩果酸和熊果酸的加樣回收率分別為 98.50%(RSD 為 3.03%)和 99.49%(RSD 為1.37%)，回收率良好。

2.9 樣品測定 分別取金葉接骨木葉和莖藥材粉末約0.5 g精密稱定，按照2.3項下方法制備供試液，按2.1項下色譜條件分別取10 μl進樣檢測，記錄金葉接骨木莖和葉的色譜圖和峰面積，見圖2，3。高效液相色譜法測得金葉接骨木莖和葉樣品中齊墩果酸與熊果酸含量，見表2。

3 討論

圖2 金葉接骨木莖供試液色譜圖Fig 2 The chromatogram of the test solution from the stem of Sambucus canadensis Aurea

圖3 金葉接骨木葉供試液色譜圖Fig 3 The chromatogram of the test solution from the leaves of Sambucus canadensis Aurea

表2 金葉接骨木莖和葉中齊墩果酸和熊果酸含量(mg/g)Tab 2 The contents of oleanolic acid and ursolic acid in the stem and the leaves of Sambucus canadensis Aurea(mg/g)

齊墩果酸與熊果酸均屬三萜類化合物，結構相似，其理化性質相近，因而在色譜柱上的保留時間非常相近，如果柱效不高并且流動相選擇不當時，很難將其分開。本實驗采用HPLC法同時測定金葉接骨木莖葉中的這兩種成分時，采用調節流動相的pH值，并加大流動相中水的比例，可以有效地將兩者分開。在2.1所述色譜條件下，取對照品溶液進樣10 μl檢測，理論塔板數為5 000，齊墩果酸和熊果酸分離度為1.6。本法定量準確，回收率高，并能同時測出齊墩果酸與熊果酸的含量，簡單易行，可做為同時含有齊墩果酸與熊果酸植物的測定標準。

金葉接骨木在我國多省區均有栽培，其枝繁葉茂，資源豐富，能否如接骨木屬植物一樣具有藥用價值，本次實驗為進一步開發和利用其植物提供了一定的科學依據。

［1］ 曹兵，宋麗華，馬國彬，等.銀川地區14種綠化樹種的引種試驗報告［J］.農業科學研究，2007，28(3):72.

［2］ 陳武，李開泉，熊筱娟，等.陸英抗肝炎活性成分的研究［J］.南昌大學學報:理科版，2001，25(2):165 －167.

［3］ 趙淑紅，高亦瓏，徐力生，等.銀川引種金葉接骨木藥用價值初探［J］.寧夏醫學雜志，2010，32(1):58 －59.

［4］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版1部)［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄28－30.

［5］ 鄒盛勤，陳武.地榆中烏索酸和齊墩果酸含量的高效液相色譜測定［J］.時珍國醫國藥，2006，17(8):1373 －1374.