Pirh2蛋白在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

王建亭， 林 楠 (首都醫科大學附屬北京朝陽醫院耳鼻咽喉頭頸外科，首都醫科大學耳鼻喉科學院，首都醫科大學耳鼻咽喉頭頸科學教育部重點實驗室， 北京 100020)

泛素－蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是近年來發現的細胞中重要的非溶酶體蛋白降解途徑，在各種不同的癌蛋白或者轉錄調節因子的降解方面發揮重要作用。泛素連接酶Pirh2是泛素連接酶E3家族中的一個新成員，其參與了泛素－蛋白酶體途徑，可通過調控抑癌基因p53的表達，進而調節腫瘤細胞的發生和發展。目前，Pirh2在喉癌組織中表達及其與臨床病理特征之間的關系尚未見報道，本研究采用免疫組織化學方法檢測Pirh2蛋白在喉癌組織中的表達水平，探討Pirh2蛋白表達與喉鱗狀細胞癌(LSCC)臨床分期、組織學分級和頸部淋巴結轉移等臨床病理特征之間的關系，探討Pirh2在喉鱗狀細胞癌發生和發展中所起的作用，為喉癌的診治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 隨機收集2004－2009年我院有完整臨床資料的原發性喉鱗狀細胞癌手術切除標本存檔蠟塊57例(喉癌組)，其中16例同時保留有癌旁相臨的安全緣以外的正常喉黏膜組織(對照組)。57例患者中，男47例，女10例;年齡33－72歲，平均(46.56 ±1.89)歲;聲門上型19 例，聲門型35例，聲門下型3例;按UICC2002年TNM分期方案進行分期，其中Ⅰ期30例，Ⅱ期16例，Ⅲ期7例，Ⅳ期4例;組織學分級，其中 G133例，G217例，G37例;經病理證實有淋巴結轉移12例，無淋巴結轉移45例。所有病例術前均未行放、化療。病理診斷均為LSCC。全部患者均有完整的隨訪資料。

1.2 試劑 鼠抗人單克隆Pirh2抗體(sc-166293)購自美國Santa Cruz公司，鼠SP免疫組織化學染色試劑盒(SP-9002)購自北京中山生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學檢測Pirh2蛋白表達 取存檔蠟塊，4 μm厚切片脫蠟入水，梯度乙醇水化，3%H2O2消除內源性過氧化物酶的活性，微波修復抗原，5% －10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，甩出血清，滴加1∶500一抗，37℃孵育1 h，滴加生物素標記二抗，室溫孵育1 h，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，顯色劑顯色(DAB)，蘇木精復染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結果。以PBS液代替一抗為陰性對照，以已知Pirh2陽性切片為陽性對照。結果判定:陽性表達主要為胞質呈棕黃色著色。所有切片采用雙盲法閱片，每張切片任選5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，共計500個細胞，計算陽性細胞所占比例，并據此對染色結果分級，Pirh2陽性率﹤25%為陰性(－)，pirh2陽性率 25% －50%為陽性(+)，pirh2陽性率≥50%為強陽性(++)。

1.4 統計學分析 采用SPSS11.5統計軟件對實驗數據進行統計分析，組間比較采用χ2檢驗，Fisher確切概率法，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測 Pirh2蛋白表達結果Pirh2蛋白在喉癌組和對照組的陽性表達主要定位于胞質，呈棕黃色(見圖1)，Pirh2蛋白在喉癌組及對照組中陽性表達率分別為77.19%(44/57)和18.75%(3/16)，差異具有統計學意義(P ＜0.01)。

圖1 Pirh2蛋白在喉癌組織中表達 (SP，×200)Fig 1 Pirh2 protein expression in larynx cancer tissues(SP，×200)

2.2 Pirh2蛋白表達與喉癌臨床病理學特征之間的關系 Pirh2蛋白陽性表達率與喉癌患者年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期及淋巴結轉移均無關，與喉癌組織學分級有關，見表1。

表1 Pirh2在喉癌組織中表達與臨床病理學特征之間的關系 例(%)Tab 1 Relationship between expression of Pirh2 and clinicopathological features in larynx cancer cases(%)

3 討論

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科較常見的惡性腫瘤，其發病率呈逐年增長趨勢，隨著分子生物學技術的發展，原癌基因的激活和抑癌基因的失活已被認為是腫瘤發生、發展的一個重要環節。泛素－蛋白酶體途徑主要經細胞內的蛋白酶體降解泛素化的蛋白質，由泛素激活酶E1、泛素轉移酶E2和泛素連接酶E3共同完成，參與了細胞的信號轉導、有絲分裂和分化，是蛋白質降解的重要途徑，已經成為腫瘤學研究中的新熱點。泛素－蛋白酶體途徑中只有泛素連接酶E3識別底物具有特異性，所以目前的研究大多集中在E3上。泛素連接酶Pirh2是2003年發現的一個分子量約為30 kD的蛋白質，是泛素連接酶E3家族中的一個新成員，由261個氨基酸組成，其中第145－186位是其環指結構域所在，即泛素連接酶的活性中心。Pirh2因含一個環指結構域而具有E3的功能，可以泛素化降解抑癌基因p53，參與腫瘤的形成，已經被定義為癌基因［1，2］。

Pirh2在惡性腫瘤的主要生物學行為與其所特有的分子結構鋅指H2環狀區域密切相關，p53作為腫瘤抑制因子在整個惡性腫瘤的發生發展過程中起到非常重要的作用，Pirh2由p53誘生，Pirh2通過自身相互作用和泛素介導的蛋白質降解的作用負反饋調節p53，控制著p53的水平，進而調節腫瘤細胞發生和發展。Pirh2與肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等關系的相關研究已有報道［3－7］，而 Pirh2與喉癌關系的相關研究尚未見報道。本研究發現，喉癌組Pirh2陽性表達率為77.19%(44/57)，顯著高于對照組Pirh2陽性表達率18.75%(3/16)，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。提示Pirh2在喉癌的發生、發展中起著一定作用。本研究中，在喉癌不同組織學分級中，G1與G2+G3級比較，Pirh2陽性表達率差異有統計學意義(P＜0.05)，提示Pirh2過表達與喉癌的惡性程度有關。本研究還顯示，Pirh2陽性表達與喉癌患者的年齡、性別、臨床分型(腫瘤部位)、臨床 TNM分期和淋巴結轉移均無關，提示Pirh2過表達只是喉癌發生、發展過程中一個較早期的重要分子事件。

本研究結果表明，Pirh2可能與喉癌的發生和發展有關，Pirh2在喉癌組織中高表達，Pirh2高表達與喉癌的組織學分級有關，檢測Pirh2表達可能為判斷喉癌的惡性程度提供理論依據。Pirh2作為一種癌基因，如能阻斷其高表達，或許對指導喉癌治療有一定價值。

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