尼可地爾預處理保存大鼠離體心臟的實驗研究

張國彬 劉亞楠 張 宇

(1.河北聯合大學研究生學院，唐山 063000;2.河北聯合大學免疫學教研室，唐山 063000;3.華北煤炭醫學院附屬醫院胸心外科，唐山 063000)

離體心臟的保存效果很大程度上決定心臟移植的成功與否［1］，目前主要通過改良心臟保存液的成分來延長心臟保存時間［2-4］。有研究［5-7］表明缺血預處理(ischemic preconditioning，IP)能顯著增強心臟對缺血的耐受性，但它是一種損傷性的預適應。藥物預處理［8-11］(pharmacological preconditioning)安全有效，通過藥物激發或模擬機體內源性的保護機制起作用。研究［12］表明七氟烷預處理對心肌細胞的保護作用可能與HSP70表達有關。本研究旨在探討非選擇性KATP通道開放劑尼可地爾預處理誘導心肌細胞HSP70表達的改變，從而揭示離體供心的可能保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取24只成年SD雄性大鼠，體質量250～350 g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司〔動物許可證號:SYXK(冀)2005-0038〕，溫度22℃，濕度50%飼養。12 h光照/黑暗，自由攝食進水。

1.2 實驗樣品和試劑

尼可地爾購自美國Sigma公司，丙二醛(malonaldehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，兔多克隆HSP70一抗、生物素化山羊抗兔IgG二抗、SP-9000免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 St-Thomas心肌保存液配方

Component Concentration/(mmol·L －1)__NaCl 100.0 NaHCO3 10.0 KCl 16.0 MgCl2·6H2 O 16.0 CaCl2·2H2 O 1.2______pH___________________________________________________7.8±0.02

1.4 動物分組及標本取材

大鼠采用抽簽法隨機分為2組，每組12只。對照組與實驗組均注射相同劑量的0.9%氯化鈉注射液或尼可地爾(0.1 mg/kg)，每天1次，第9次注射結束后10%水合氯醛麻醉并肝素化。剪開胸骨暴露心臟，阻斷升主動脈，在主動脈根部注射4℃ St-Thomas液4～6 mL，待心臟完全停搏，心外膜變白后，摘除心臟，迅速修剪后放入4℃心肌保存液中。

1.5 心肌組織MDA含量測定

分別在2、4、6、8、10、12、16、20、24 h 取左心室前壁心肌組織制成勻漿液，離心取上清。硫代巴比妥酸法測定MDA含量，具體操作過程按照試劑盒。

1.6 心肌組織電鏡超微結構測定

各時間點取0.1 cm ×0.1 cm ×0.1 cm 體積的大鼠離體心肌，并置于電鏡固定液，超薄切片電鏡觀察。

1.7 免疫組化法檢測

各時間點標本取材置于10%中性甲醛4℃固定24 h常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。全層心肌連續切片，厚度約5 μm，用經粘片劑處理過的載玻片撈片，置于60℃烤箱烘烤3 h后行S-P法免疫組化染色。滴加HSP70一抗4℃過夜(1∶150)，滴加二抗37℃孵育1 h，DAB顯色。多媒體彩色病理分析系統計數，取均值。

1.8 蛋白質印跡法檢測

標本取材加3倍體積細胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5 min，12 000 r/min離心取上清?？捡R斯亮藍法測定各時間點樣本的蛋白含量后，取蛋白樣品40 μg與等體積上樣緩沖液混合，95℃煮沸10 min，10%SDS-PAGE膠分離蛋白，轉膜，封閉液室溫下震蕩1 h，加入HSP70一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，TBST洗滌并曝光，洗膜敷βactin并作定量分析。

1.9 統計學方法

采用計算機圖像分析系統對免疫組化陽性細胞數進行定量分析。所有數據采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差()表示，同一時間點不同處理組間比較采用雙因素方差分析，組間比較采用Bonferroni檢驗;同一處理組不同時間點比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett t檢驗，相關性采用Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織MDA含量測定

供心置入保存液后，實驗組及對照組MDA含量均表現為逐漸升高，同一時間點相比差異有統計學意義(P＜0.01)。實驗組供心保存8 h MDA含量明顯增加，與保存6 h相比差異無統計學意義;10 h MDA含量增加趨勢顯著，與8 h相比差異有統計學意義(P＜0.01)。對照組供心保存4 h MDA含量即明顯增加，保存6 h后MDA含量增加顯著，差異有統計學意義(P＜0.01)。結果見表1及圖1。

表1 2組中各時間點MDA的含量測定Tab.1 The concentrations of MDA in the two groups of control and NCR at different time points()(nmol/mg)

表1 2組中各時間點MDA的含量測定Tab.1 The concentrations of MDA in the two groups of control and NCR at different time points()(nmol/mg)

＊＊ P ＜0.01 vs control group;MDA:malonaldehyde;NCR:nicorandil.

Time/h Control group NCR group 2 1.98 ±0.55 0.35 ±0.09＊＊2.13 ±0.57 0.37 ±0.09＊＊6 2.94 ±0.55 0.53 ±0.10＊＊8 4.02 ±0.97 1.28 ±0.24＊＊10 5.31 ±1.34 2.70 ±0.42＊＊12 6.34 ±0.11 3.29 ±0.12＊＊16 7.15 ±0.17 4.42 ±0.14＊＊20 7.70 ±0.17 4.36 ±0.22＊＊______24___________________________________________________8.24_±0.17_5.19±0.18 4＊＊________

2.2 心肌組織電鏡超微結構觀察

對照組保存6 h的供心可見心肌細胞水腫明顯，局灶性肌絲斷裂溶解消失，染色體邊集，線粒體嵴模糊、部分消失、線粒體間空泡較多、線粒體內出現空泡及致密顆粒(圖1A)。實驗組低溫保存8 h的離體心臟心肌細胞尚完整，肌絲、肌節排列稍紊亂，線粒體輕度腫脹有空泡化，增生明顯，嵴較亂(圖1B)。

圖1 實驗組和對照組離體心肌組織的超微結構Fig.1 The ultrastructure of myocardial tissue in two groups(6 600×)

2.3 尼可地爾組和對照組各時間點心肌組織HSP70免疫組化測定結果

對照組各時間點心肌組織僅見少量HSP70陽性細胞，各時間點HSP70表達量明顯少于實驗組(P＜0.01)(表2，圖2A)。與對照組比較，尼可地爾預處理組離體后2 h可見中量胞核呈棕黃色的HSP70陽性細胞;6 h達到高峰，可見大量胞核呈黃褐色陽性細胞，明顯高于其他時間點(P＜0.05)(圖2B);隨離體心臟保存時間延長，HSP70陽性細胞數逐漸減少，最終24 h時僅見胞核少量陽性細胞，數量明顯減少。

表2 2組不同時間點HSP70陽性細胞數Tab.2 The HSP70 positively stained cells in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

表2 2組不同時間點HSP70陽性細胞數Tab.2 The HSP70 positively stained cells in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control group;NCR:nicorandil.

Time/h Control group NCR group 2 1.02 ±0.16 67.01 ±5.04＊＊1.31 ±0.21 66.60 ±4.66＊＊6 1.72 ±0.42 79.68 ±6.18＊＊8 1.89 ±0.33 74.45 ±4.46＊＊10 1.68 ±0.35 65.99 ±5.80＊＊12 0.84 ±0.29 43.27 ±4.07*16 0.80 ±0.19 25.49 ±3.27*20 0.78 ±0.27 15.41 ±2.88*______24___________________________________________________0.66_±0.32_2.25_±0.72 4*_________

2.4 尼可地爾預處理組及其對照組心肌組織HSP70蛋白印跡測定結果

與實驗組相比，對照組各時間點只有微量HSP70蛋白表達(表3，圖3A)(P＜0.01)。尼可地爾預處理組離體后2 h HSP70蛋白中量表達;至6 h即可見大量HSP70蛋白表達，表達量大于同組其他時間點(圖3B)(P＜0.01);隨離體心臟保存時間延長，HSP70表達水平逐漸下降，但離體24 h后仍高于對照組(P＜0.01)。

2.5 心臟損傷指標MDA與HSP70表達的相關關系比較

Spearman相關分析顯示:MDA與HSP70陽性細胞數、HSP70蛋白表達量之間均有明顯負相關性(r1= －0.724，P ＜0.05;r2= －0.715，P ＜0.05)，差異具有統計學意義。

3 討論

1967年首例人類心臟移植成功以來，心臟移植效果隨著心臟保存技術的改進有了顯著提高［1，13］。缺血預處理和熱預處理作為有效的心臟保存方式畢竟是一種損傷性過程，而且最佳時間、安全時限及個體差異等問題使其臨床應用受到限制。使用藥物替代缺血進行預處理來保存離體心肌具有更大的臨床意義。

圖2 對照組和實驗組HSP70蛋白免疫組化圖Fig.2 The expression of HSP70 in two groups(400×)

表3 2組不同時間點HSP70蛋白印記結果Tab.3 The expression of HSP70 protein in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

表3 2組不同時間點HSP70蛋白印記結果Tab.3 The expression of HSP70 protein in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

＊＊ P ＜0.01 vs control group;NCR:nicorandil.

Time/h control group NCR group 2 0.98 ±0.10 4.51 ±0.31＊＊1.05 ±0.15 3.67 ±0.41＊＊6 1.15 ±0.21 5.28 ±0.33＊＊8 1.58 ±0.34 4.71 ±0.46＊＊10 1.17 ±0.18 3.92 ±0.43＊＊12 0.89 ±0.12 2.88 ±0.33＊＊16 1.02 ±0.16 3.51 ±0.21＊＊20 0.81 ±0.12 0.93 ±0.25＊＊24 0.72 ±0.11 1.52 ±0.61 4＊＊

圖3 2組不同時間點HSP70蛋白水平表達Fig.3 The expression of HSP70 protein in two groups at different time point

研究［14］表明七氟烷預處理新生大鼠心肌細胞過程中，鉀離子ATP通道抑制劑可以抑制HSP70的表達。為了進一步研究鉀離子ATP通道與HSP70在離體心肌保存中的關系，我們使用鉀離子ATP通道開放劑尼可地爾預處理大鼠。與對照組相比，尼可地爾預處理組過氧化產物丙二醇MDA含量增加不多，隨著保存時間的延長其心肌超微結構也有所改善。這提示尼可地爾預處理和低溫保存離體心臟可以使供心的心肌結構改變較輕微，對大鼠離體心臟的保存有利。本研究前期試驗提示，尼可地爾、去甲腎上腺素、黃芪、硝酸甘油、倍他樂克、三七、川芎嗪等都能誘導在體心肌表達內源性HSP70，而尼可地爾的誘導作用最強。本實驗進一步動態觀察了尼可地爾預處理誘導離體心臟HSP70的表達規律。免疫組化和免疫印記結果表明在低溫保存條件下，實驗組各時間點HSP70蛋白表達量均顯著大于對照組，實驗組在6 h就達到高峰，而且主要定位于細胞核。相關分析結果表明心臟損傷程度指標MDA與HSP70表達呈顯著負相關，進一步提示HSP70為離體心肌的保護因素之一。有研究［15］認為細胞內HSP70短暫高表達可減輕因ATP耗竭引起的細胞毒性和蛋白毒性效應。另外由于冷存離體心臟仍保持低水平的新陳代謝，所以仍可表達痕量HSP70，但由于代謝緩慢和底物不足，隨時間延長，其表達量也明顯降低。本實驗證實在體尼可地爾誘導后離體心臟仍能表達保護性HSP70，并且呈現一定的表達規律，提示藥物預處理確能對離體心臟提供一定的保護作用。

尼可地爾預適應的機制非常復雜，本文僅初步探討了誘導型HSP70所起的作用，具體的分子機制如HSP70與KATP的關系有待進一步研究。

［1］Hatayama N，Yoshida Y，Seki K.A study on the perfusion preservation，resuscitation，and transplantation of a rat heart isolated for 96 hours［J］.Cell Transplant，2009，18(5):529-534.

［2］Michel P，Hadour G，Chiari P，et al.Evaluation of a new preservation solution for hypothermic heart transplant［J］.Ann Cardiol Angeiol(Paris)，2000，49(6):367-376.

［3］Yang Q，Zhang R Z，Yim A P，et al.Histidine-tryptophanketoglutarate solution maximally preserves endothelium-derived hyperpolarizing factor-mediated function during heart preservation:comparison with University of Wisconsin solution［J］.J Heart Lung Transplant，2004，23(3):352-359.

［4］Kajihara N，Morita S，Tanoue Y，et al.The UW solution has greater potential for longer preservation periods than the Celsior solution:comparative study for ventricular and coronary endothelial function after 24-h heart preservation［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2006，29(5):784-789.

［5］Takagi H，Hsu C P，Kajimoto K，et al.Activation of PKN mediates survival of cardiac myocytes in the heart during ischemia/reperfusion［J］.Circ Res，2010，107(5):642-649.

［6］Basgut B，Kayki G，Bartosova L，et al.Cardioprotective effects of 44Bu，a newly synthesized compound，in rat heart subjected to ischemia/reperfusion injury［J］.Eur J Pharmacol，2010，640(1-3):117-123.

［7］Shackebaei D，Godini A，Reshadat S.The effects of diazepam in cardio depressant concentration on the function of isolated rat heart in ischemia-reperfusion［J］.Saudi Med J，2008，29(6):847-853.

［8］Naderi R，Imani A，Faghihi M.Phenylephrine produces late pharmacological preconditioning in the isolated rat heart［J］.Eur J Pharmacol，2010，627(1-3):203-208.

［9］Wisel S，Khan M，Kuppusamy M L，et al.Pharmacological preconditioning of mesenchymal stem cells with trimetazidine(1-〔2，3，4-trimethoxybenzyl〕piperazine)protects hypoxic cells against oxidative stress and enhances recovery ofmyocardial function in infarcted heart through Bcl-2 expression［J］.J Pharmacol Exp Ther，2009，329(2):543-550.

［10］Khanna G，Diwan V，Singh M，et al.Reduction of ischemic，pharmacological and remote preconditioning effects by an antioxidant N-acetyl cysteine pretreatment in isolated rat heart［J］.Yakugaku Zasshi，2008，128(3):469-477.

［11］Joyeux-Faure M，Ramond A，Beguin P C，et al.Early pharmacological preconditioning by erythropoietin mediated by inducible NOS and mitochondrial ATP-dependent potassium channels in the rat heart［J］.Fundam Clin Pharmacol，2006，20(1):51-56.

［12］Tang Y，Wang Q Y.Effects of sevoflurane-induced and anoxia-induced preconditioning on HSP70 expression in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao，2003，28(2):129-132.

［13］Hing A J，Watson A，Hicks M，et al.Combining cariporide with glyceryl trinitrate optimizes cardiac preservation during porcine heart transplantation［J］.Am J Transplant，2009，9(9):2048-2056.

［14］Tang Y，Wang Q，Li J.Influence of KATP channel inhibitor on the changes of HSP70 expression in sevoflurane-induced neonatal rat cardiomyocytes［J］.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2003，34(4):653-655.

［15］Kabakov A E，Budagova K R，Latchman D S，et al.Stressrful preconditioning and HSP70 over-expression attenuate proteotoxicity of cellular ATP depletion［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2002，283(2):521-534.