腦膠質瘤MGMT啟動區甲基化PCR檢測方法的對比分析

李杰飛 孫彥輝 劉福生 金貴善 柴 奇 張紅波

(北京市神經外科研究所腦腫瘤研究中心，首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，北京 100050)

異常的甲基化和各種基因的失活在惡性腫瘤中很常見。甲基化的檢測方法有很多種，近些年臨床上常用的檢測方法是甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)法。本研究采用傳統MSP和巢式MSP兩種方法來檢測MGMT啟動區甲基化的狀態，并采用免疫組織化學的結果作為兩種MSP法檢測結果的參考，比較這兩種方法的優缺點，為以后臨床廣泛開展此項檢測和腦膠質瘤患者化療方案的制訂提供較為可靠的依據。

1 材料和方法

1.1 腫瘤標本的收集

隨機收集2009年4月至2010年3月首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科收治的54例腦膠質瘤患者的腫瘤標本，其中男性28例，女性26例，年齡19～74歲，平均(46.2±14.40)歲。根據膠質瘤分類分級標準［1］，星形細胞瘤7例，少枝膠質細胞瘤2例，少枝-星形細胞瘤16例，間變性星形細胞瘤1例，間變性少枝膠質細胞瘤2例，間變性少枝-星形細胞瘤3例，膠質母細胞瘤23例。其中在38例膠質瘤中獲得了腫瘤中心和周邊兩個不同部位的標本，共獲得92份標本，其中有77份標本可以分成兩部分，一部分保存在液氮中，用于DNA提取，另一部分保存在10%的甲醛中，用于石蠟切片。另外15份標本由于標本量少，只檢測了MGMT啟動區甲基化的狀態。

1.2 DNA提取和亞硫酸氫鹽的修飾

采用基因組DNA快速提取試劑盒(由北京金馳同信科技發展有限公司提供)提取DNA。用DNA甲基化修飾試劑盒(由北京天漠科技開發有限公司提供)對上述抽提的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。

1.3 MGMT啟動區甲基化狀態的檢測

分別采用傳統MSP和巢式MSP兩種方法對每份標本的DNA進行擴增。根據參考文獻［2-5］進行引物的合成，詳見表1。

表1 甲基化特異性PCR引物Tab.1 Primer of methylation specific PCR

傳統MSP:甲基化引物為M-f和M-r，非甲基化引物為 U-f和 U-r。反應體系 50 μL:模板 DNA 0.20 μg、10 μmol/L 引物各1.5 μL、ZymoTapTMPreMix 25 μL。反應條件:95℃ 10 min，95℃ 30 s、各自退火溫度30 s、72℃ 30 s，35個循環后72℃延伸10 min，4℃保存。

巢式MSP:第一步PCR的引物為Pan-f和Pan-r，反應體系5 0μL:模板DNA 0.20μg、1 0μmol/L引物各 1.5 μL、ZymoTapTMPreMix 25 μL。反應條件:95 ℃10 min，95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 個循環后72℃延伸10 min，4℃保存;第一步的反應產物稀釋50倍，取5 μL PCR產物用于第二步PCR擴增。第二步PCR的引物同傳統 MSP，反應體系50 μL:模板DNA 5 μL、10 μmol/L引物各1.5 μL、ZymoTapTMPreMix 25 μL。反應條件:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、各自退火溫度15 s、72℃ 15 s，35個循環后72℃延伸10 min，4 ℃保存。

為保證檢測的可靠性，以正常外周血淋巴細胞DNA以及經SssI甲基轉移酶(由美國New England Biolabs公司提供)處理過的正常外周血淋巴細胞DNA分別作非甲基化和甲基化的對照。取5 μL PCR擴增產物在含有溴化乙啶的4%瓊脂糖凝膠上電泳50 min，電壓5 V/cm，DNA Marker 20 bp為相對分子質量標準，用凝膠成像分析儀(WD-9413B，北京市六一儀器廠)觀察分析電泳結果。

結果判定:電泳結果中出現非甲基化條帶(U)擴增，而不出現甲基化條帶(M)擴增，判斷為非甲基化;僅M條帶或U和M條帶均出現擴增，則判定為甲基化。詳見圖1。

1.4 免疫組化染色

MGMT的免疫組化染色采用DAB顯色法。一抗為MGMT兔抗人多克隆抗體(由北京博奧森生物技術有限公司提供)，抗體滴度為1∶200。結果判定:無著色細胞為陰性(－)，著色程度很弱不易判斷，或陽性細胞＜10%為可疑陽性(±)，陽性細胞數在10%～30%為陽性(+)，陽性細胞數 ＞30%為強陽性(++)。詳見圖2。

圖1 MGMT啟動區甲基化狀態的檢測Fig.1 Methylation specific PCR analysis of the MGMT promoter methylation status

圖2 MGMT在腦膠質瘤組織中的表達Fig.2 MGMT expression in glioma tissue(DAB，400×)

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，敏感率和陽性率的比較采用配對χ2檢驗，MGMT啟動區甲基化狀態與MGMT表達的相關分析采用Spearman秩和相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種檢測方法敏感率的比較

在傳統MSP法檢測中，92份腫瘤標本中獲得檢測結果的有56份，敏感率為60.9%，在巢式MSP檢測中獲得了所有標本的檢測結果，敏感率為100%。配對樣本的卡方檢驗 χ2=34.03，P ＜0.05，兩者的差異有統計學意義。詳見表2。

表2 傳統MSP和巢式MSP敏感率的比較Tab.2 The comparison of sensitive rate analyzed by conventional MSP and nested MSP

2.2 2種檢測方法甲基化陽性率的比較

傳統MSP和巢式MSP都獲得檢測結果的標本有56份。在巢式 MSP法檢測的56份標本中，46份MGMT啟動區甲基化，10份MGMT啟動區非甲基化，甲基化陽性率為82.1%;巢式MSP法檢測的同樣56份標本中，39份MGMT啟動區甲基化，17份MGMT啟動區非甲基化，甲基化陽性率為69.6%。傳統MSP和巢式MSP檢測都為甲基化的標本有39份，傳統MSP和巢式MSP檢測都為非甲基化的標本有17份，傳統MSP檢測甲基化而巢式MSP檢測非甲基化的標本有7份，傳統MSP檢測非甲基化而巢式MSP檢測甲基化的標本不存在，配對樣本的卡方檢驗 χ2=5.14，P ＜0.05，兩種檢測方法陽性率差異有統計學意義。詳見表3。

表3 傳統MSP和巢式MSP甲基化陽性率的比較Tab.3 The comparison of methylated positive rate analyzed by conventional MSP and nested MSP

2.3 傳統MSP法檢測的甲基化狀態與蛋白表達的關系

傳統MSP和免疫組化都獲得檢測結果的標本有46份，其中在39份甲基化標本中，23份MGMT蛋白表達陰性，在7份非甲基化標本中，5份MGMT蛋白表達陽性。Spearman秩相關系數 r= －0.255，P=0.087，根據這組數據尚不能認為MGMT啟動區甲基化狀態與其蛋白表達有相關性。詳見表4。

2.4 巢式MSP法檢測的甲基化狀態與蛋白表達的關系

巢式MSP和免疫組化都獲得檢測結果的標本有77份，其中在61份甲基化標本中，39份MGMT蛋白表達陰性，在16份非甲基化標本中，12份MGMT蛋白表達陽性。Spearman秩相關系數r=－0.318，P=0.005，MGMT啟動區甲基化狀態與其蛋白表達呈負相關。詳見表5。

表4 MGMT啟動區甲基化狀態與蛋白表達的關系Tab.4 The correlation between MGMT promotor methylation status and its expression(conventional MSP)

表5 MGMT啟動區甲基化狀態與蛋白表達的關系Tab.5 The correlation between MGMT promotor methylation status and its expression____________(nested MSP)

3 討論

MGMT啟動區甲基化狀態的檢測對膠質瘤患者術后化療方案的制訂和預后的判斷具有重要意義。甲基化的檢測方法主要有MSP法、甲基化敏感的限制性內切酶法和基因測序等方法。基因測序法是一種可靠性及精確度均很高的方法，但需要大量的克隆測序，操作過程繁瑣且費用昂貴，不適合廣泛應用于臨床。目前臨床上最常用的是MSP法，MSP法有傳統MSP和巢式MSP兩種方法。本研究對比分析傳統MSP和巢式MSP兩種檢測方法的優缺點，并采用免疫組化的結果作為兩種MSP檢測結果的參考，探討這兩種方法中更適合于臨床開展此項檢測的方法。

巢式MSP僅比傳統MSP多一次PCR循環，操作過程簡便。在本實驗中巢式MSP法檢測的敏感率為100%，傳統 MSP法檢測的敏感率為 60.9%(χ2=34.03，P ＜0.05)。巢式 MSP 的敏感性高于傳統MSP。這是因為用于甲基化檢測的DNA是經過亞硫酸氫鹽修飾的，絕大部分DNA模板被破壞，所以增加了傳統MSP擴增的難度。而巢式MSP第一次擴增是利用外引物從多個位點同時進行特異性和非特異性擴增，用于第二次擴增的兩對引物(巢式引物)位于第一對引物的內側，只能與第一次PCR產生的特異性產物互補，因此增加了檢測的敏感性，解決了模板破壞過多帶來擴增困難的問題。因此從敏感性上說，巢式MSP更適于開展此項檢測。

根據傳統MSP檢測46份標本的甲基化狀態與其表達的數據尚不能認為MGMT啟動區甲基化的狀態與其蛋白表達有相關性(r= －0.255，P=0.087)，而巢式MSP檢測77份標本的甲基化狀態與其蛋白表達呈負相關性(r= －0.318，P=0.005)。又因為 MGMT的表達主要受其啟動區甲基化狀態的調控，MGMT啟動區甲基化，MGMT表達較少，MGMT啟動區非甲基化，MGMT表達較多［6-7］。所以巢式MSP的檢測結果可能更接近真實情況。本實驗巢式MSP檢測的甲基化陽性率為69.6%，傳統MSP檢測的甲基化陽性率為82.1%(χ2=5.14，P ＜0.05)。巢式 MSP 檢測的陽性率低于傳統MSP，因此可以認為可能是巢式MSP減少了假陽性的發生，增加了檢測的特異性。另一方面從方法學上說，在外引物的設計上，巢式MSP使沒有轉化或部分轉化的DNA不能進行擴增，這樣就避免了在第二次擴增時出現非特異性的結合［8］，從而增加了檢測的特異性。

MSP檢測的特異性還會受到引物二聚體的影響。本實驗目的基因條帶大小為81 bp和93 bp，二聚體的大小在40 bp左右，兩者相距比較近，引物二聚體的產生會增加假陽性的發生。在傳統MSP檢測中，二聚體的條帶比較明顯，而在巢式MSP中，通過減少巢式引物和增加模板等方法，可以明顯減少二聚體的產生。引物二聚體的出現從根本上說是引物自身的問題，因此解決這一問題最根本的辦法是重新設計引物。然而就MGMT引物的設計而言，它既要滿足PCR本身的要求，還要滿足甲基化檢測所需的條件。這樣在MGMT引物設計中，就存在可以形成二聚體的因素。另一方面，即使引物設計不存在引物之間的互補，仍然可能形成引物二聚體［9］。此時可以通過熱啟動、適當降低酶或引物濃度、加入適量的添加劑等方法來減少引物二聚體的形成［10］。巢式MSP在這方面明顯優于傳統MSP，雖然不能完全消除引物二聚體，但較傳統MSP能明顯減少二聚體的產生，使結果的判讀更加準確，增加了檢測的特異性。

電泳marker的選擇同樣也會影響實驗結果的判讀。本實驗研究初期采用的是100 bp的marker，到后期采用的是20 bp的marker。在研究中發現，用100 bp的marker電泳結果為僅含目的條帶的PCR產物，再用20 bp的marker電泳時，出現了非特異性條帶(大小在40 bp左右)。所以在marker的選擇上，無論是傳統MSP還是巢式MSP最好選用20 bp或50 bp的marker，不建議使用100 bp的marker。因為目的條帶大小為81 bp和93 bp，二聚體的大小在40 bp左右，兩者相距比較近，如果使用100 bp的marker，二聚體和目的條帶間沒有marker條帶，并且二聚體和目的條帶常?；煸谝黄鹦纬梢粋€較寬的條帶，在這種情況下，判定PCR的結果會容易出現偏差，會增加假陽性的發生。因此選擇合適的marker對增加檢測的特異性、準確性有著重要的意義。

在PCR條件的優化中，巢式MSP要好于傳統MSP。傳統MSP和巢式MSP在PCR擴增中經常會出現產物電泳為陰性、產物電泳出現多條非特異性條帶(含目的基因條帶)和產物電泳出現拖尾現象等情況。在巢式MSP中出現這3種情況時，筆者通過調整PCR的反應溫度、引物或模板的用量等方法順利地得到了目的基因條帶。而在傳統MSP中出現這些情況時，很難通過上述方法得到目的基因條帶。這種實驗結果表明:巢式MSP在PCR擴增條件的優化中有明顯的優勢。

此外PCR酶的來源也很重要，不同來源的酶會影響結果的重復性。本實驗初期采用的是普通PCR酶，PCR擴增的重復性較差，改用專門用于甲基化的酶后問題得以解決，其PCR擴增的效果優于普通PCR酶。

總之，相對于傳統MSP，巢式MSP不僅能提高甲基化檢測的敏感性，而且能減少假陽性的發生，提高檢測的特異性。同時巢式MSP還可以通過減少引物二聚體的形成增加檢測的特異性。通過選擇合適的marker，兩種方法都可以提高結果的準確性。巢式MSP是檢測MGMT啟動區甲基化狀態的可靠方法，其檢測結果可以為腦膠質瘤患者化療方案的制訂提供較為可靠的依據，并有助于判斷腦膠質瘤患者的預后。

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