HPV16型L1蛋白優勢表位原核表達及其血清學驗證

侯江厚，張靈霞，孫雯娜，劉艷華，楊秉芬，孫衛國

（1.昆明市婦幼保健院，云南 昆明 650013；2.解放軍總醫院第八醫學中心結核病研究所全軍結核病防治重點實驗室 結核病診療新技術北京市重點實驗室，北京 100091）

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續感染是宮頸癌的主要病因，其中HPV16型與宮頸癌的關系最為密切[1]。另外，其他癌癥，如喉癌、食管癌、骨髓癌等也與HPV16型感染相關[2]。HPV基因是雙鏈閉環DNA分子，編碼含有10個開放閱讀框架，晚期編碼區的L1蛋白結構比較保守，是HPV主要的病毒衣殼蛋白，其含有多個線性表位和構象表位，這些表位分散于整個病毒衣殼的表面，是誘發機體產生保護性體液免疫反應的主要抗原[3-4]。L1基因的最初129個核苷酸中有1個主要的RNA抑制因子[5]，該蛋白N端由15～30個疏水性氨基酸殘基組成1個保守的疏水區，這種連續疏水性氨基酸的多肽不利于蛋白在原核系統中的表達，目前獲得L1重組蛋白大多采用酵母細胞或昆蟲細胞[6]。利用原核系統表達L1雖然有諸多報道，但均未形成規模化商品，存在的問題主要是表達量太低、純化困難。本課題組前期通過序列分析軟件DNAStar對HPV16型L1蛋白的二級結構、優勢表位、親水性等多個參數進行分析，比較蛋白序列潛在的B細胞表位，同時采用BLAST同源性匹配分析來保證預測表位的特異性[7]，最終篩選出其C端335～496位氨基酸序列作為L1蛋白B細胞表位的優勢序列。孫衛國等[8]利用構建的原核融合表達載體pET-DsbC獲得多個抗原表位序列的原核可溶性表達并具有良好的生物活性，作為伴侶分子的DsbC能輔助底物蛋白進行正確的空間折疊，可表現出重組抗原的空間表位，提高血清學應用的敏感性。本研究擬將生物信息學預測的L1蛋白中的335～496位氨基酸序列通過構建pET-DsbCHPV16 L1表達載體進行原核重組、純化并檢測其免疫學活性，為后期HPV16型疫苗的研制，尤其是HPV感染的臨床血清學診斷奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

原核表達載體pET-DsbC、大腸埃希菌Rosetta（DE3）及其感受態細胞由結核病診療新技術北京市重點實驗室制備并保存。引物和全基因由華大基因公司合成，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）所需試劑、常規分子生物學實驗試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，蛋白質相對分子質量Marker DNA2000購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗人IgG抗體和化學發光檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。Ni-Sepharose chelating Sepharose Fast Flow親和樹脂填料購自美國GE公司，自行裝填純化柱。LB培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）配制試劑等均為分析純試劑。

10份HPV16型感染并發宮頸癌患者單人份血清樣本由昆明市婦幼保健院腫瘤科保存，經PCR-熒光探針法（上海之江生物科技股份有限公司）和酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（上海盈公生物技術公司）檢測確認為HPV16型陽性。10份健康人單人份血清由昆明市婦幼保健院體檢中心提供。

1.2 方法

1.2.1 全基因合成 根據谷鴻喜等[9]報道的中國婦女感染的HPV16型基因L1片段序列，對335～496位氨基酸對應的核酸序列進行全基因合成，3'端加入大腸埃希菌終止密碼子taa。5'和3'端分別引入內切酶HindⅢ和XhoⅠ位點序列，同時合成鑒定引物為：正義引物5'-gatactacacgcagtac-3'，T7反義引物5'-gctagttattgctcagc-3'。

1.2.2 pET-DsbC-HPV16 L1表達載體的構建 采用限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ對全基因合成的克隆載體pUC19- L1及表達載體pET-DsbC分別進行雙酶切，回收酶切后的L1片段和pET-DsbC，按照摩爾比3∶1的濃度混合后于16 ℃恒溫條件下連接過夜，連接產物轉化感受態大腸埃希菌Rosetta（DE3），采用菌落PCR篩選陽性克隆株并進行測序鑒定，獲得表達菌株pET-DsbCHPV16 L1。

1.2.3 重組HPV16 L1蛋白的原核表達與純化 將保存的陽性工程菌株于37 ℃震蕩培養8 h后進行活化，次日按1∶100比例轉種含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中擴大培養，當細菌生長A600nm值約為0.4時加入終濃度為0.3 m m o l的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG），然后37 ℃條件下誘導7 h，將沉淀菌體在冰浴狀態下進行超聲破碎，取上清和沉淀分別進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分析重組蛋白的表達形式。采用鎳離子螯合親和層析柱對上清進行層析（流速為1 mL/min），PBS平衡層析柱5個柱積，以50 mmol/L咪唑除去菌體自身雜蛋白，以150 mmol/L咪唑洗脫收集目的蛋白，采用12% SDS-PAGE分析重組蛋白的純度，計算純化得率。

1.2.4 重組HPV16 L1蛋白的免疫印跡法與ELISA分析 取保存的重組DsbC蛋白和重組融合蛋白DsbC-HPV16 L1，用PBS配制成1 mg/mL的母液備用，分別取2 μL進行常規15%SDS-PAGE，半干法電轉到硝酸纖維素膜上，然后分別以1∶20稀釋后的宮頸癌患者陽性血清、體檢健康者血清進行孵育，采用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate-buffered saline Tween，PBST）洗滌，以1∶3 000稀釋的HRP標記羊抗人IgG抗體進行第2次孵育，漂洗干凈后，通過化學發光暗室自動曝光顯影，采用免疫印跡法判斷該重組蛋白的抗原性。采用ELISA分析重組蛋白的免疫學活性。將用碳酸鈉鹽溶液稀釋的DsbC-HPV16 L1（終濃度為7 μg/mL）包被96孔酶標板，以DsbC蛋白作為陰性對照（包被濃度7 μg/mL），每孔100 μL包被過夜，封閉、洗板，將用PBST 1∶20稀釋的HPV16型陽性血清和健康人血清分別加入包被孔和對照孔，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，充分洗板后每孔加入1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗人IgG抗體100 μL，37 ℃震蕩孵育30 min，充分洗板，加入四甲基聯苯胺，室溫避光反應30 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應。采用GEN-PROBD酶標儀（美國ThermoFisher Scientific公司）檢測450 nm波長處的A值。

2 結果

2.1 pET-DsbC-HPV16 L1原核重組表達載體的構建

對HPV16 L1蛋白的335～496位氨基酸對應的核酸序列進行分析，按大腸埃希菌密碼子偏性、使用頻率和優化RNA結構的原則進行全基因合成，然后克隆到pET-DsbC表達載體上，以設計的鑒定引物進行PCR鑒定，1%瓊脂糖核酸電泳顯示片段大小為570 bp，與預期值相符，見圖1。經測序鑒定證實構建成功。

圖1 HPV16 L1 C端核酸PCR鑒定凝膠電泳結果

2.2 DsbC-HPV16 L1融合蛋白表達與純化

DsbC-HPV16 L1融合表達載體經轉化大腸埃希菌Rosetta（DE3）宿主菌后以IPTG誘導，可獲得目的蛋白的原核表達，冰浴超聲破碎后進行SDS-PAGE。結果顯示，在目的相對分子質量46 000處（DsbC蛋白為28 000）有明顯的蛋白表達，目的蛋白占菌體蛋白的30%以上。超聲破碎后的上清液中可溶目的蛋白占表達蛋白的50%以上。見圖2。

圖2 HPV16 L1原核表達產物分析

超聲破碎后的上清液以親和層析純化，150 mmol/L咪唑洗脫獲得的純化融合蛋白經SDSPAGE分析，純度為95%，見圖3。采用BCA蛋白定量法（重組蛋白純化得率=純化后的目的蛋白/上樣前上清液總蛋白×50%）計算得重組蛋白純化得率為22%。

圖3 DsbC-HPV16 L1親和純化后的電泳分析分析結果

2.3 重組融合蛋白抗原性的免疫印跡法結果

以重組DsbC蛋白為陰性對照，采用免疫印跡法分析原核系統獲得的重組DsbC-HPV16 L1蛋白的抗原性。以HPV16型陽性血清為一抗，HRP標記的羊抗人IgG為二抗。獲得的重組DsbC-HPV16 L1蛋白與HPV16型陽性血清產生特異的抗原-抗體反應，與重組DsbC蛋白或健康人血清無交叉反應。該重組蛋白具有特異的抗原性。見圖4。

圖4 DsbC-HPV16 L1重組蛋白免疫印跡法分析結果

2.4 DsbC-HPV16 L1融合蛋白免疫反應性的ELISA分析結果

以重組DsbC-HPV16 L1蛋白、重組DsbC蛋白為包被抗原，采用ELISA檢測宮頸癌患者血清特異性HPV16 L1抗體水平。重組DsbC-HPV16 L1蛋白與HPV16型陽性血清有較強的免疫反應性，A450nm均值為0.56，高于健康人血清和PBS陰性對照（A450nm均值分別為0.24和0.21）。重組DsbC蛋白與HPV16型陽性血清、健康人血清和PBS陰性對照的A450nm均值分別為0.31、0.30和0.28，三者之間無差異。見圖5。

圖5 重組DsbC-HPV16 L1蛋白、重組DsbC蛋白與HPV16型陽性血清、健康人血清和PBS陰性對照的ELISA結果

3 討論

針對HPV的九價疫苗目前已在國內上市，接種后可誘導出良好的預防效果。英國葛蘭素史克公司研發的二價疫苗Cervarix和美國默克公司研發的四價疫苗Gardasil在預防宮頸癌方面有良好的效果[10]，但價格昂貴。通過原核表達系統、酵母表達系統、桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統以及轉基因植物等均可獲得重組HPV16 L1蛋白，但原核系統，尤其是以大腸埃希菌作為宿主菌具有代時短、易控制、遺傳背景清楚和廉價等特點，是基因工程工藝首選的宿主菌。重組HPV L1蛋白含有HPV大部分抗原表位，其在多種表達體系中均能自我組裝成病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）。VLP具有與天然病毒相似的抗原表位和免疫學特性，以VLP免疫動物，獲得的免疫血清顯示出良好的活性，HPV L1蛋白或其優勢表位序列可以成為預防性疫苗或疫苗的組成部分。由于HPV L1蛋白含有較多的稀有密碼子和較復雜的結構，國內外雖然有成功利用原核系統完整表達L1蛋白的報道[11]，但因表達量低、包涵體復性困難，很難開發成成規模化工藝。本研究通過對HPV16 L1蛋白的氨基酸序列進行分析，同時通過信息學軟件對其B細胞表位進行綜合預測，發現其C端335～496位氨基酸含有較豐富的B細胞表位，與王愛萍等[12]預測的結果較為一致。對這段序列進行密碼子和二級結構的優化，通過原核系統獲得了HPV16 L1蛋白C端的高效可溶性融合表達，重組蛋白的純化得率為22%。血清學驗證結果顯示，重組DsbC-HPV16 L1蛋白與HPV16型陽性血清能產生特異的抗原-抗體反應，且有較強的免疫反應性。目前，篩查宮頸癌患者HPV主要采用PCR技術，存在著假陽性問題，且取材也有一定的困難，因此經典的血清學方法，如ELISA更為適合。以本研究獲得的重組蛋白為抗原建立檢測HPV16型的ELISA方法，將為宮頸癌患者或類似疾病患者進行早期預防篩查或術后復查提供一種簡單、可行的方法。本研究的局限性在于陽性樣本量較小，后期將擴大樣本量，進一步驗證本研究結果，以期能研制出新型的檢測試劑盒，造福患者。

綜上所述，本研究采用原核表達系統實現了HPV16型L1蛋白優勢抗原表位的可溶性高表達，獲得的重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫學活性，這為HPV預防性疫苗、宮頸癌早期篩查及臨床診斷試劑的開發奠定了基礎。