槐米多糖的提取和純化工藝研究

摘要：為探討中藥槐米中可溶性粗多糖的提取工藝，通過單因素試驗和Ｌ９（３３）正交試驗，研究了提取溫度、料水質量比、提取時間對多糖提取率的影響。結果顯示，３個因素對多糖提取率的影響順序為提取時間、料液比、提取溫度，最佳提取工藝為提取溫度９０ ℃，料水質量比１∶１５，提取時間９０ ｍｉｎ，所得槐米粗多糖的提取率為５．１０％。對槐米粗多糖脫蛋白方法的研究顯示木瓜蛋白酶＋Ｓｅｖａｇ法脫蛋白處理效果優于Ｓｅｖａｇ法和３％三氯乙酸法。

關鍵詞：槐米多糖；提取工藝；正交試驗

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3161-03

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉng Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ

ＺＨＯＵ Ｙｉｎｇ，ＸＩＡ Ｘｉｎ－ｋｕｉ

（Ｘｉｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｘｉｎｙａｎｇ ４６４０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ of Ｌ９（３３） ｗere ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｒａｔｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｉｍｅ ｈａｄ ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｉｍｐａｃｔ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｗｈｉｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｈａｄ ｔｈｅ ｌｅａｓｔ ｉｍｐａｃｔ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ９０ ℃， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １∶１５（m/V，g∶mL）； ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｉｍｅ ９０ ｍｉｎ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ ｗａｓ ５．１０％． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍ ｃｒｕｄｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ｓｅｖａｇ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ papain ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ Ｓｅｖａｇ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｏｎｅ ｏｒ ３％ ＴＣＡ ｍｅｔｈｏｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； orthogonal design

多糖作為參與生命活動的基本物質之一，常是細胞表面信號識別、抗原抗體反應、細胞間信息的傳遞和感受的關鍵因子，在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面均起到一定的作用。多糖種類繁多，廣泛存在于動物、植物、微生物中。為充分開發多糖資源，近年來我國對植物多糖，特別是具有中國特色的中草藥多糖的藥物活性進行了廣泛研究。槐米（Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ）別名白槐、柚花、槐蕊，為豆科植物槐（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌ．）的花蕾或花朵，性微寒，味苦［１］。近代醫學研究證明，槐米具有一定的抑菌、抗癌、保健等藥理作用，其主要成分蘆丁具有抗菌消炎，防止血管破裂和止血作用，對紫外線具有極強的吸收作用，而且具有很好的抗氧化作用［２，３］。但對槐米多糖的研究還鮮見報道。以槐米粗多糖的提取率為考察指標，采用單因素試驗和Ｌ９（３３）正交試驗對提取過程中溫度、料液比、提取時間３因素進行了優化；對粗多糖的脫蛋白方法進行了選擇，旨在為槐米多糖的開發利用提供參考。

１材料和方法

１．１材料和儀器

１．１．１材料槐米購自信陽市藥材公司，產地為河南，經信陽農業高等專科學校藥用植物教研室鑒定為中藥槐米。

１．１．２試劑甲醇、乙醇、丙酮、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、三氯乙酸、木瓜蛋白酶均為國產分析純。Ｓｅｖａｇ試劑：氯仿與正丁醇體積比為５∶１。

１．１．３主要儀器電熱恒溫水浴槽，北京市醫療設備廠；Ｚ３２３Ｋ高速冷凍離心機，德國ＨＥＲＭＬ公司；７５２紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

１．２試驗方法

１．２．１槐米粗多糖的提取稱取粉碎的槐米干品粉末２００ ｇ，甲醇回流脫去表面脂肪，抽濾，藥渣風干。再用８０％乙醇回流除去小分子糖、苷類、生物堿等，藥渣風干。然后分別取藥渣５ ｇ，以水作為溶劑，采用不同的提取溫度、料水質量比、提取時間對藥渣提取多糖。水提液離心除去雜質，減壓濃縮至小體積，加無水乙醇至濃度為７５％，沉淀；靜置２４ ｈ后過濾，用９５％乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌數次，真空干燥，得槐米粗多糖。按下列公式計算粗多糖提取率：

１）單因素試驗。分別考察提取溫度、料水質量比及提取時間對提取率的影響。①提取溫度：分別在５０、６０、７０、８０、９０ ℃溫度下，料水質量比為１∶１２，提取４５ ｍｉｎ。②料液比：固定提取溫度為８０ ℃，提取時間４５ ｍｉｎ，分別以１∶８、１∶１０、１∶１２、１∶１５、１∶１８的料水質量比進行提取試驗。③提取時間：固定提取溫度８０ ℃，料水質量比１∶１２，分別以３０、４５、６０、９０、１２０ ｍｉｎ提取槐米粗多糖。

２）正交試驗。選取提取溫度、料水質量比、提取時間３個因素，參照單因素試驗，各設置３個水平進行正交試驗，因素及水平見表１。

１．２．２粗多糖的純化

１）指標測定。①蛋白質含量：利用紫外吸收法測定粗多糖中蛋白質的含量［４］。配制多糖粗品溶液，以水作為空白對照，分別于２８０ ｎｍ和２６０ ｎｍ測吸光度值，根據經驗公式：蛋白質濃度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝１．４５×Ａ２８０nm－０．７４×Ａ２６０nm即可求得樣品溶液中蛋白質的濃度。②多糖含量：采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量［５］。

２）脫蛋白處理。分別采用３種方法對粗多糖進行脫蛋白處理。①Ｓｅｖａｇ法［６］：根據蛋白質在氯仿等溶劑中變性的特點，加入多糖溶液１／５體積的Ｓｅｖａｇ溶液，混合后劇烈振蕩２０ ｍｉｎ，離心除去變性蛋白質沉淀，重復５次，再濃縮、醇沉、洗滌、真空干燥。②３％三氯乙酸法［６］：在多糖溶液中滴加３％三氯乙酸，直至溶液不再渾濁，５～１０ ℃放置過夜，離心除去膠狀蛋白，再濃縮、醇沉、洗滌、真空干燥。③木瓜蛋白酶＋Ｓｅｖａｇ法：將木瓜蛋白酶按蛋白酶、多糖質量比１∶２０加入多糖溶液中，于７０ ℃在恒溫磁力攪拌器中保溫５ ｈ，再按①的方法加入Ｓｅｖａｇ溶液，重復３次，再濃縮、醇沉、洗滌，真空干燥。將３種方法獲得的脫蛋白粗多糖分別配成０．０５ ｍｇ／ｍＬ的樣品液，測定蛋白質及多糖含量。

２結果與分析

２．１提取工藝優化結果

２．１．１溫度對提取率的影響溫度過低，不利于多糖物質的溶出；而溫度過高，容易引起多糖降解，反而不利于多糖的提取。由圖１可以看出，提取率先隨溫度升高緩慢升高，到７０ ℃時升高速度較快，８０～９０ ℃為較理想的提取溫度。

２．１．２料水質量比對提取率的影響一般來說，只要能將活性物質溶出，料水質量比越大越好，因為料水質量比過小會給以后的濃縮帶來不便。從圖２看出，提取率隨料水質量比的減小先呈上升趨勢，至１∶１５時達到最大，之后隨料水質量比的減小而下降。

２．１．３時間對提取率的影響延長提取時間會提高提取率，但當細胞中的有效成分已完全溶出時，再延長提取時間不但不能提高提取率，反而會增加提取液中雜質的含量。由圖３看出，提取率先隨時間的延長而增加，到６０ ｍｉｎ時提取率達到最大，此后再延長提取時間，提取率反而下降。

２．１．４正交試驗結果由表２可見，不同因素水平對提取率有明顯的影響，其中提取時間對提取率影響最大，提取溫度的影響最小。以提取率為目標，則最佳提取方案為Ａ３Ｂ３Ｃ３，即提取溫度９０ ℃，料水質量比１∶１5，提取時間９０ ｍｉｎ。由于最優提取工藝沒有包含在正交試驗內，進行了驗證試驗。在最佳條件下提取槐米粗多糖，所得提取率為５．１０％，高于其他試驗組合。

２．２脫蛋白方法優化結果

蛋白質是粗多糖中的主要雜質，它們所帶電荷可吸附大量其他雜質，使其他雜質的去除變得困難，而且還會吸附多糖，增加了多糖分離的難度。所以要獲得純度較高的多糖，就必須進行脫蛋白處理。由表３可知，①Ｓｅｖａｇ法對蛋白質的去除率達９４．１１％，但同時多糖損失達５３．６４％，此法對于蛋白質結合多糖的處理較為困難，容易一起絮凝沉淀，造成樣品多糖的損失，且需要多次重復，耗時較長。②三氯乙酸法對于蛋白質的去除率也較高，但同樣多糖的損失率大，達６９．８８％，且此法較為劇烈，容易引起某些多糖的降解。③木瓜蛋白酶＋Ｓｅｖａｇ法利用木瓜蛋白酶切斷蛋白鏈，水解了大部分結合蛋白和游離蛋白，有利于多糖物質的溶出，同時也降低了多糖溶液的黏稠度，再配以Ｓｅｖａｇ法，不僅脫蛋白效率高，達９９．２１％，且多糖的損失大大降低，有利于真空濃縮和槐米多糖的進一步純化，優于其他兩種提取方法。

３結論

為了優化槐米多糖的提取方法，研究了槐米多糖的提取工藝及３種脫蛋白方法，得出如下結論：

１）以水為溶劑進行提取，控制水浴溫度為９０ ℃，料水質量比為1∶15，提取時間９０ ｍｉｎ，提取３次，即可得到較高的提取率。

２）脫蛋白過程中，與酶結合Ｓｅｖａｇ法相比，從蛋白質的脫除率和多糖的損失率來看，兩種化學法（Ｓｅｖａｇ法和３％三氯乙酸法）脫蛋白效率均不如酶結合Ｓｅｖａｇ法，酶結合Ｓｅｖａｇ法操作簡便、高效、毒性小，是理想的脫蛋白方法。

參考文獻：

［１］ 丁寶章，王遂義，高增義． 河南植物志（第一冊）［Ｍ］． 鄭州：河南科學技術出版社，１９８８．

［２］ 中國藥材公司． 中國中藥資源志要［Ｍ］． 北京：科學出版社，１９９４．

［３］ 黃海蘭，李俊，徐波． 槐米抗食用油脂氧化活性及其成分研究［Ｊ］． 食品科學，２００７，２８（８）：８６－８９．

［４］ 馬如復． 生物化學實驗［Ｍ］． 武漢：武漢大學出版社，１９９８．

［５］ 李俊，韓向暉，李仲洪，等． 茯苓多糖的提取及含量測定［Ｊ］． 中國現代應用藥學，２０００，１７（１）：４９－５０．

［６］ 方積年． 多糖的分離純化及其純度鑒別與分子量測定［Ｊ］． 藥學通報，１９８４，１９（１０）：４６－４９．