苧麻脫膠高效菌劑活化技術研究

摘要：ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑在４～８℃冷藏柜中保存540 d，分段取樣進行成活率檢測，開展高效菌劑活化技術研究。結果表明，ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，其成活率保持在８０％以上；該菌劑活化技術具有工藝流程短、技術難度小等特點，采用常規培養基對高效菌劑進行蘇醒與擴增（６、８ ｈ）、誘導（５ ｈ）兩個步驟，即可獲得６ ｈ完成苧麻脫膠的活化菌液；確保高效菌劑活化成功的關鍵在于掌握“休眠態的高效菌劑在蘇醒與擴增過程的適應期長短與保存期呈正相關”的技術原理。其結果可為降低企業實施苧麻生物脫膠工藝的技術風險、長期保持高效菌劑的優良性能提供科學依據。

關鍵詞：苧麻脫膠；高效菌劑；活化技術

中圖分類號：Ｓ５６３．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3136-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｒａｍｉｅ Ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ

ＦＥＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｙｕａｎ，ＬＩＵ Ｚｈｅｎｇ－ｃｈｕ，ＤＵＡＮ Ｓｈｅｎｇ－ｗｅｎ，ＺＨＥＮＧ Ｋｅ，ＣＨＥＮＧ Ｌｉ－ｆｅｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｔ Ｆｉｂｅｒ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２０５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＸＪＺＵ－１２０ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ４～８ ℃ ｉｎ ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒ ｗｉｔｈｉｎ 540 d ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ by step dyeing． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ，ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｏｖｅｒ ８０％ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ 540 d， ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ ａｗａｋｅｎｉｎｇ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ６、８ ｈ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ５ ｈ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｒａｍｉｅ ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ６ ｈ； ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｏｐｅｒａｂｌｅ， ａｎｄ ｓｏ ｏｎ； ｔｈｅ ｋｅｙ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｉｓｋ ａｎｄ ｋｅｅｐｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｍｉｅ ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ； ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ； ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

隨著當今世界能源的緊缺以及國家對環保力度的加強，草本纖維資源的開發已引起了人們的高度重視。鑒于草本纖維的提取沿用普遍的傳統和化學方法造成對環境的污染等問題［１－２］，中國農業科學院麻類研究所工程酶項目組針對草本纖維原料的特性，對從自然界分離并采用基因工程手段選育的一個高效菌株進行了系列研究［３－５］，研究形成了“苧麻生物脫膠工藝技術與設備（ＺＬ９５１１２５６４．８）［６］”、“歐文氏桿菌工廠化發酵快速提取苧麻纖維工藝（ＺＬ ０７ １ ０３０５３４０．５）［７］”以及“一種草本纖維工廠化脫膠或制漿用高效菌劑制備方法（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）［８］”等發明專利。同時，應用這些專利技術在湖南沅江市明星麻業有限公司、湖北精華紡織集團有限公司等單位建成了高效節能清潔型苧麻生物脫膠示范工程。

本研究在前期研究基礎上，專門生產了一批高效菌劑在適宜溫度下進行了長期保存，擬通過定期取樣進行活化與鑒定，以期獲得高效菌劑活化技術，為降低企業實施苧麻生物脫膠工藝的技術風險、長期保持高效菌劑的優良性能提供科學依據。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１高效菌劑ＣＸＪＺＵ－１２０菌株２００５年，通過紫外線誘變歐文氏桿菌ＣＸＪＺ９５－１９８而獲得變異菌株，２００７年４月以來在高效節能清潔型苧麻生物脫膠示范工程推廣應用的菌種。制備方法詳見發明專利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）說明書。高效菌劑采用可滅菌離心管分裝，塑料真空袋外包裝，４～８℃冷藏柜保存１８個月。

１．１．２活化培養基①蘇醒與擴增培養基。主要組分為葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、ＮａＣｌ、保護劑，自來水配制，自然ｐＨ值，滅菌后備用；②誘導培養基。主要組分為豆餅粉、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、誘導劑，自來水配制，自然ｐＨ值，滅菌后備用。

１．２方法

１．２．１高效菌劑活化前檢測保存期分別為１、３、５、７、３０、９０、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０ ｄ，取出高效菌劑用顯微鏡進行觀測，主要檢測菌體草酸銨結晶紫染色深淺程度，每個樣品取５個視野數出深色菌體（活菌）、淺色菌體（軀殼或死菌）的數量，加權平均可計算出活菌所占比例；比較并記錄菌體形態是否有變化。同時，采用平板計數法測定不同保存期樣品的活菌量，與分裝前高效菌劑活菌量進行比較并計算出活菌所占比例。

１．２．２高效菌劑活化①蘇醒與擴增。按照蘇醒與擴增培養基２％的比例添加不同保存期的高效菌劑，３５ ℃，１８０ ｒ/min振蕩１０ ｈ；②誘導。按照誘導培養基２％的比例接種蘇醒與擴增菌液，３５ ℃，１８０ ｒ/min振蕩５ ｈ。

１．２．３高效菌劑活化效果檢測①蘇醒與擴增過程。采用７５５Ｂ型紫外／可見分光光度計檢測ＯＤ６００nm變化情況［９］；②誘導培養液（活化菌液）用于苧麻生物脫膠試驗。浴比為１∶１０，菌液稀釋５０倍，用自來水配制接種菌液，分裝到５００ ｍＬ錐形瓶中（３００～３５０ ｍＬ／瓶），預熱至３５ ℃，將３０～３５ ｇ苧麻置于接種菌液中浸泡１５ ｍｉｎ，倒出接種余液，置于３５ ℃恒溫恒濕培養箱中發酵６ ｈ。按照本課題組創立的“麻管實效法”記錄脫膠結果。

２結果與分析

２．１高效菌劑保存過程的監測結果

２．１．１保存過程活菌數量變化情況根據試驗設計方案，定期取出不同保存期的高效菌劑進行觀測，結果列于表１。由表１可見，兩種方法檢測不同保存期的高效菌劑成活率變化趨勢基本相同，數值比較接近。平板計數數值偏低，原因可能是極少數染色深的菌體實際成活能力不強；高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，依然有８０％以上的成活率；成活率下降比較快的時段在５～３０ ｄ，保存90 d以后的成活率下降幅度比較緩慢。

２．１．２保存過程菌體形態變化情況圖１為高效菌劑保存３０ ｄ稀釋１００倍樣品的隨機視野顯微照片。照片中有９０％以上、染色較深的長桿狀菌體，通過平板計數，證明它們就是可以活化出來的正常菌體；同時，也有少數形態不很規則而且染色較淺的菌體，可能就是實際成活能力不強的菌體或者死亡的菌體軀殼。

２．２高效菌劑活化效果監測結果

２．２．１高效菌劑蘇醒與擴增過程ＯＤ值檢測結果如圖２所示。由圖２ 可知，保存期在540 d以內的高效菌劑，經過８～１０ ｈ蘇醒與擴增，均可形成ＯＤ600nm超過１．５的活化態菌液；保存期在７ ｄ以內的高效菌劑，其適應期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 d以內，其適應期在４ ｈ左右，保存期超過90 d，其適應期長達５ ｈ。概括起來說，處于休眠態的高效菌劑在蘇醒與擴增過程的適應期長短與保存期呈正相關。可以說，這就是高效菌劑活化工藝的技術原理。只要掌握了這個原理，就能根據高效菌劑保存期的長短適當調節蘇醒與擴增的時間，就可以獲得理想的高效菌劑活化效果。

２．２．２活化菌液用于苧麻生物脫膠試驗將６、８ ｈ蘇醒與擴增菌液進行誘導培養５ ｈ以后，接種到苧麻上進行濕潤發酵６ ｈ，觀測脫膠效果見表２。表２結果表明，保存期在540 d以內的高效菌劑，經過８ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養５ ｈ以后，接種到苧麻上進行濕潤發酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠；保存期在３０ ｄ以內的高效菌劑，經過６ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養５ ｈ以后，接種到苧麻上進行濕潤發酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠。

３結論

１）在４～８ ℃下保存540 d的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑還有較高成活率。結果表明，按照發明專利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）說明書生產的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑，在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d以后，成活率還有８０％以上，經過８ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養５ ｈ，接種到苧麻上進行濕潤發酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑活化技術具有工藝流程短、技術難度小等特點。無論是蘇醒與擴增培養基還是誘導培養基的主要組分都屬于常規物質。不同保存期的高效菌劑只需要經過６～８ ｈ蘇醒與擴增和５ ｈ誘導培養這兩個簡單的工藝過程（累計１１～１３ ｈ），均可形成用于苧麻脫膠的活化菌液，接種到苧麻上濕潤發酵６ ｈ就能完成苧麻脫膠。

３）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑活化的關鍵在于掌握菌劑活化技術原理。處于休眠態的高效菌劑在蘇醒與擴增過程的適應期長短與保存期呈正相關，這就是高效菌劑活化的技術原理。結果顯示，保存期在７ ｄ以內的高效菌劑，其適應期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 ｄ以內，其適應期在４ ｈ左右，保存期超過90 ｄ，其適應期長達５ ｈ。結果還顯示，保存90 ｄ以上的高效菌劑經過６ ｈ蘇醒與擴增所獲得的菌液誘導培養５ ｈ，接種到苧麻上進行濕潤發酵６ ｈ，不能完成苧麻脫膠。

４討論

１）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑保質期的界定。本試驗僅以高效菌劑成活率、活化菌液用于苧麻脫膠的效果等指標對不同保存期的高效菌劑進行了活化技術研究，沒有嚴格按照保質期的指標要求設計試驗方案，可能是一個缺陷。苧麻是一種原產于中國、盛產于中國的特色農產品［１０］，通過脫膠（初加工）獲得的產品僅用作紡織工業等制造業的基礎材料，附加值不會很高，在目前的科學技術和生產力水平下，采用高效菌劑進行苧麻脫膠應該說是合適的選擇，也是最近取得的突破性成果，但是目前國內外沒有相關標準可以借鑒。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑成活率下降速率不一致的原因。根據生物活體休眠保存理論，高效菌劑成活率下降速率應該與保存時間呈線性關系。但是，試驗結果顯示，高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 ｄ，依然有８０％以上的成活率，成活率下降比較快的時段在５～３０ ｄ，保存90 ｄ以后的成活率下降幅度比較緩慢。其原因有待進一步研究。

參考文獻：

［１］ 劉正初．用科學發展觀看我國草本纖維產業前景［Ｊ］．中國麻業科學，２００７，２９（B2）：６８－７１．

［２］ 劉正初．麻類纖維提取工程微生物研究回顧與展望［Ｊ］．中國農業科學，２００７，４０（Z1）：３６３－３６７．

［３］ 劉正初，彭源德，馮湘沅，等．苧麻生物脫膠新技術工業化生產應用研究［Ｊ］．紡織學報，２００１，２２（２）：27－29．

［４］ 劉正初，張運雄，馮湘沅，等．清潔型草本纖維生物提取工藝的污染機理研究［Ｊ］．中國農業科學，２００８，４１（２）：５４６－５５１．

［５］ 顧佳佳，劉正初，張運雄，等．ＣＸＪＺ９５－１９８菌株果膠酶活力檢測的方法研究［Ｊ］．中國麻業科學，２００６，２８（６）：３０９－３１２．

［６］ 劉正初，彭源德，馮湘沅，等．苧麻生物脫膠工藝技術與設備［Ｐ］．中國專利：ＺＬ ９５１１２５６４．８，１９９６－０９－０４．

［７］ 劉正初，彭源德，馮湘沅，等．歐文氏桿菌工廠化發酵快速提取苧麻纖維工藝［Ｐ］．中國專利：ＺＬ ０７１０３０５３４０．５，２００８－０８－０６．

［８］ 劉正初，彭源德，馮湘沅，等．一種草本纖維工廠化脫膠或制漿用高效菌劑制備方法［Ｐ］．中國專利：ＺＬ ０２１０８８２０．９，２００３－１０－２２．

［９］ 李學貴，袁生．微生物轉化過程中利用ＯＤ值實時監測細菌生物量變化的研究［Ｊ］．南京師大學報（自然科學版），２００３，２６（４）：９０－９３．

［１０］ 劉正初．我國苧麻產業發展的前景與對策［Ｊ］．中國麻作，１９９５， １７（１）：４５－４６．