三種方法提取不同品種梨葉片總RＮA

摘要：為篩選出提取梨葉片總ＲＮＡ的最佳方法，以梨極矮化突變體和蘋果梨為材料，采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒、ＳＤＳ法和改良ＣＴＡＢ法提取其葉片總ＲＮＡ并比較提取效果。結果表明，改良ＣＴＡＢ法能有效抑制酚類物質和多糖對總ＲＮＡ提取的影響，獲得純度高、完整性好的總ＲＮＡ，其２８ Ｓ ｒＲＮＡ條帶亮度高于１８ Ｓ ｒＲＮＡ，所提取的ＲＮＡ適合下一步的研究使用。

關鍵詞：梨；ＲＮＡ提取；柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒；改良ＣＴＡＢ法；ＳＤＳ法

中圖分類號：Ｓ６６１．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3204-03

Three Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｐｅａｒ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ

ＧＯＮＧ Ｙａｎ－ｍｉｎｇ，ＣＡＯ Ｈｏｕ－ｎａｎ，ＺＯＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｗｅｎ，ＪＩＮ Ｃａｎ，ＸＵ Ｘue

（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｙａｎbｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ １３３００２，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｈｏｏｓｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ ｌｅａｖｅｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔs ｏｆ Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡｏｕｔ， ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｐｅａｒ ｄｗａｒｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ Ｐｉｎｇｇｕｏｌｉ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ａｓ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｇｏｔ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ of ＲＮＡ． Ｔｈｅ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｎｄ ｏｆ ２８Ｓ ｒＲＮＡ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ １８Ｓ ｒＲＮＡ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａｒ； ＲＮＡ extraction； Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡｏｕｔ； ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ

根據植物不同種屬或組織間各異的生理特性篩選出適宜的ＲＮＡ提取方法，是提取完整性好、純度高的ＲＮＡ，進而進行基因克隆與表達分析的前提［１］。木本植物的組織和細胞有厚實且堅韌的細胞壁，較多的單寧、酚、醌等次生代謝物質以及蛋白質、多糖等有機大分子［２］。在ＲＮＡ提取過程中，這些物質中有的會與ＲＮＡ不可逆地結合，有的會與ＲＮＡ共同沉淀下來，不僅降低提取效率，而且嚴重干擾后續的反轉錄反應、酶切反應和體外擴增［３－５］。因此，快速且高效地沉淀ＲＮＡ、抑制ＲＮＡ酶的活性、去除多糖和其他次生代謝物質，是ＲＮＡ提取的關鍵［６］。

梨極矮化突變體是在延邊小香水梨實生后代中偶然發現的實生矮化突變體，其抗寒性強于Ｓ２、ＯＨ×Ｆ５１、ＯＨ×Ｆ６９和ＰＤＲ５４等砧木，且抗病性也較強，是梨屬植物中少有的既矮化又具有較強抗性的資源［７］。與蘋果梨、小香水、南國梨等品種相比，極矮化種質的葉片較大、葉色濃綠、質地較厚，含有更多的酚類和多糖。針對以上特點，本研究分析比較了柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒、改良ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取梨極矮化突變體和蘋果梨葉片總ＲＮＡ的效果，以期為多酚多糖植物葉片總ＲＮＡ的提取提供參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１實驗材料梨極矮化突變體葉片、蘋果梨葉片，采自延邊大學農學院果樹試驗場，液氮速凍后

－７０ ℃低溫冰箱保存。

１．１．２試劑柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；反轉錄酶Ｍ－ＭＬＶ（ＲＮａｓｅ Ｈ－）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８購自寶生物工程（大連）有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（ＣＴＡＢ）、焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、β－巰基乙醇（ＢＭＥ）、十二烷基硫酸鈉（ＳＤＳ）購自長春市德雙科技有限責任公司；其余試劑均為國產分析純。

１．２方法

１．２．１葉片總ＲＮＡ的提取及檢測采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒、改良ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法３種方法提取葉片總ＲＮＡ，取所得產物２ μＬ，經１％瓊脂糖凝膠（含ＥＢ ０．５ μｇ／ｍL），１２０ Ｖ恒壓電泳１５ ｍｉｎ檢測總ＲＮＡ的質量。具體提取方法如下：

１）試劑盒法：參照柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒說明書操作。

２）ＣＴＡＢ法：參考Ｃｈａｎｇ等［８］的方法并略作改動，具體步驟如下：①取８０ ｍｇ左右樣品，在液氮中研磨成粉末后迅速裝入１．５ ｍＬ離心管中，加入７００ μＬ ６５ ℃預熱的提取緩沖液［１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，２％ ＣＴＡＢ， ２％ ＰＶＰ，２％～３％ β－巰基乙醇（用前加入）］，渦旋２～３ ｍｉｎ，６５ ℃水浴２０～３０ ｍｉｎ，中途渦旋２～３次；②加入提取緩沖液０．６倍體積的氯仿，渦旋２～３ ｍｉｎ；③４ ℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；④轉移上清液至新的１．５ ｍＬ離心管，加入１／３體積預冷的１０ ｍｏｌ／Ｌ ＬｉＣｌ，混合均勻，－２０ ℃沉淀１ ｈ；⑤重復步驟③，棄上清；⑥７５％乙醇清洗沉淀后，加入５００ μＬ ０．１％的ＤＥＰＣ水溶解沉淀；⑦加入０．８倍體積酚與氯仿（體積比為１∶１）渦旋２ ｍｉｎ，室溫靜置５ ｍｉｎ；⑧重復步驟③；⑨轉移上清至一個新的離心管，并加等體積氯仿抽提１次，上清中加１／１０體積的５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．８）和２～２．５倍冷無水乙醇，－２０ ℃沉淀１ ｈ；⑩１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，收集ＲＮＡ，７５％乙醇清洗沉淀１～２次，風干，加入２０～３０ μＬ ０．１％的ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，－７０ ℃保存備用。

３）ＳＤＳ法：參考王壯偉等［９］的方法進行。

１．２．２ＲＴ－ＰＣＲ擴增梨Ａｃｔｉｎ基因以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８為反轉錄引物，１ μｇ改良ＣＴＡＢ法提取的總ＲＮＡ為模板，Ｍ－ＭＬＶ（ＲＮａｓｅ Ｈ－）反轉錄酶催化合成ｃＤＮＡ第一鏈，具體操作按反轉錄酶說明書進行。根據ＧｅｎＢａｎｋ登錄的西洋梨Ａｃｔｉｎ基因序列，設計一對特異引物：ＰｂＡＣＴＦ：５’ＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴ

ＣＣ３’，ＰｂＡＣＴＲ：５’ＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧ３’。ＰＣＲ反應體系為２５ μＬ，含模板第一鏈ｃＤＮＡ １ μＬ，上下游引物各１．５ μＬ（１０ μｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １．５ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．２ μＬ（５ Ｕ／μＬ），１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，其余用去離子水補充。ＰＣＲ反應條件為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性４５ ｓ，６０ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃，５ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物經１％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

２結果與分析

２．１３種方法提取的葉片總ＲＮＡ質量

３種方法所提取的蘋果梨總ＲＮＡ均有較明顯的２８ Ｓ、１８ Ｓ和較弱的５ Ｓ條帶出現，而除了改良ＣＴＡＢ法外，其他兩種方法均不能提取出高質量的梨極矮化突變體總ＲＮＡ（圖１～３）。由圖１、圖２可以看出采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒和ＳＤＳ法提取的梨極矮化突變體ＲＮＡ條帶較暗，其中圖２－Ａ ４條泳道中僅前兩條有ＲＮＡ條帶，排除操作因素后，多次實驗證明ＳＤＳ法提取效果不穩定；此外這兩種方法提取的ＲＮＡ條帶雖然較亮，但２８ Ｓ和１８ Ｓ條帶亮度基本相同，顯示存在降解現象。另外這兩種方法均有蛋白質和ＤＮＡ等雜質的殘留。

從圖３可以看出，ＣＴＡＢ法提取的梨極矮化突變體和蘋果梨葉片總ＲＮＡ條帶均很亮，且２８ Ｓ條帶比１８ Ｓ條帶亮，沒有觀察到蛋白質或ＤＮＡ雜質的殘留，得到的ＲＮＡ質量較高。但是圖３－Ａ中１、２泳道的條帶不規則，說明可能有少量多糖存在，而圖３－Ｂ中１～４泳道的條帶均完整規則，說明ＣＴＡＢ法提取的蘋果梨總ＲＮＡ質量比梨極矮化突變體總ＲＮＡ要好，且多次操作穩定性較強。

２．２Ａｃｔｉｎ基因的ＲＴ－ＰＣＲ擴增結果

以改良ＣＴＡＢ法提取的ＲＮＡ為模板進行反轉錄，使用特異引物擴增Ａｃｔｉｎ基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產物片段大小約為２５０ ｂｐ，與預期相符（圖４）。說明所提取的ＲＮＡ質量較好，可以用于后續研究。

３討論

目前，對于木本植物不同種、不同部位ＲＮＡ的提取，研究人員已經總結出許多科學高效的方法［１０－１３］，但是在實際操作過程中，即使相同種屬的不同個體，用一套固定的提取方法也不能保證取得同樣的效果。梨極矮化突變體與蘋果梨相比，葉片厚且葉色更為濃綠，含有更多的糖類和酚類物質，將研磨后的樣品加入到提取緩沖液中時，高含量的糖類物質使樣品黏稠結塊，不能充分與緩沖液接觸。而且，在相同的研磨條件下，梨極矮化突變體比蘋果梨更容易發生褐變，影響了ＲＮＡ的提取效果。本實驗的ＣＴＡＢ法減少了樣品用量，以起到充分裂解樣品的作用；提高了β－巰基乙醇的用量，β－巰基乙醇作為強還原劑可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵使之失活［８］，從而抑制氧化反應，避免褐化；分別采用１０ ｍｏｌ／Ｌ ＬｉＣｌ和５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ兩次沉淀去除多糖，效果十分明顯。ＣＴＡＢ法提取蘋果梨和梨極矮化突變體總ＲＮＡ質量雖然均較好，但在提取穩定性方面，前者明顯強于后者，說明此法用于提取高酚高糖植物提取ＲＮＡ，仍需進一步改進。

試劑盒法提取的ＲＮＡ，存在降解和雜質污染現象，不利于ＲＮＡ的后續利用；ＳＤＳ法和改良ＣＴＡＢ法相比，雖然避免了高溫可能帶來的ＲＮＡ降解的風險，而且用時短，步驟簡單，但是提取的ＲＮＡ存在雜質污染。兩種方法提取的蘋果梨ＲＮＡ質量均高于梨極矮化突變體，說明這兩種方法對高酚高糖植物ＲＮＡ的提取效果不明顯。王壯偉等［９］應用ＳＤＳ／酚法從蘋果屬組培苗中得到了高質量、完整性好的總ＲＮＡ，但筆者應用該方法并未得到質量合格的梨極矮化突變體ＲＮＡ，可能與不同種屬植物的生理特性有關。另外，組培苗的離體生長環境決定了其體內的生長代謝不同于大田植物，這可能是造成ＳＤＳ法在本實驗中不能取得良好效果的另一原因。因此，在參考已報道的ＲＮＡ提取方法的前提下根據材料的特性做適當的改良，才會獲得預期的總RNA提取效果。

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