

摘要:采用利血平復制脾虛證小鼠模型,觀察銀杏葉復方制劑對實驗性脾虛證模型小鼠內臟器官發育及其抗氧化酶活性的影響。結果表明,①銀杏葉復方組小鼠胃、腎的指數較脾虛模型組有所提高但差異不顯著(P>0.05);銀杏葉復方組小鼠小腸、脾的指數顯著高于脾虛模型組(P<0.05),與對照組差異不顯著(P>0.05);脾虛模型組小鼠的肝、肺指數顯著高于銀杏葉復方組(P<0.05),銀杏葉復方組小鼠的肝、肺指數與對照組差異不顯著(P>0.05),提示銀杏葉復方有促進脾虛小鼠脾胃發育和促進肝臟的解毒作用,對脾虛模型小鼠的腎、肺功能亦有改善作用。②銀杏葉復方組小鼠脾臟、腎臟中MDA含量較脾虛模型組顯著降低(P<0.05),而肝臟組織中SOD和GSH-Px含量較脾虛模型組顯著提高(P<0.05),同時脾臟、腎臟和肝臟中T-AOC含量較脾虛模型組顯著提高(P<0.05)。提示銀杏葉復方對脾虛小鼠的脾臟、腎臟和肝臟的功能有良好的保護作用。
關鍵詞:銀杏葉復方;脾虛證;利血平;內臟器官;抗氧化酶;小鼠
中圖分類號:S816.79文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2011)15-3120-04
Effect of Ginkgo biloba Compound on Development of Visceral Organs and Antioxidase Activity of Spleen Deficiency Mouse
LI Yan1,2,YANG Xiao-yan1,2,WANG Hua1,2,ZHOU Xiao-qiong1,3,WANG Qian-jin1,YANG Hui1
(1.Collge of Life Science of Longyan University, Longyan 364000,Fujan ,China;
2. Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Educational Commission of Fujian Province,Longyan 364000,Fujan ,China;
3.Fujian Engineering Research Center for Prevention and Control of Zoonosis and Viral Diseases; Longyan 364000,Fujan ,China)
Abstract: Spleen deficiency mouse induced by reserpine were used to investigate the effect of ginkgo compound on the development of visceral organs and their antioxidase activity. The experimental mouse were divided into three groups including ginkgo compound group (GC), spleen deficiency group (SD) and control group (Control). The results suggested that ginkgo biloba compound could promote the development of spleen and stomach and accelerate the detoxication of liver, and also improve the function of kidney and lung of spleen deficiency mouse. The indexes including stomach, kidney, small intestine and spleen in GC appeared higher than those in SD while the indexes of small intestine and spleen were significantly higher, but the indexes of liver and lung in GC were significantly lower than in SD, whereas no significant difference among all indexes was found between GC and the control group. Compared with SD group, it was found that the MDA content in the spleen and kidney of GC group was significantly lower, while the SOD and GSH-Px content in liver and the T-AOC content in spleen, kidney and liver were significantly higher.
Key words: ginkgo biloba compound; spleen deficiency syndrome; reserpine; visceral organs; antioxidase; mice
銀杏(Ginkgo biloba L.)是現存種子植物中最古老的孑遺植物[1]。銀杏葉被用作藥物已有500余年的歷史,早在宋朝我國民間就已使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。現代藥理學研究表明,銀杏葉及其提取物中含有豐富的黃酮類活性物質和萜內酯等有效成分,具有抗氧化、清除體內有毒游離自由基、擴張血管、保護機體組織和耐缺氧、抗脂質過氧化、改善神經調節功能等作用[2]。我國不僅是銀杏資源的古國,而且是銀杏資源大國,擁有量占全世界總量的70%以上,具有較大的開發優勢,但對銀杏葉的開發利用尚處于起步階段,落后于世界上一些先進國家,較長時間停留在葉子出口或提取粗產品的水平,造成了國有資源的浪費[3]。銀杏葉的食用安全性較高[4],目前臨床上銀杏葉制劑和復方銀杏葉制劑多用于治療心血管疾病,有關銀杏葉及其復方制劑用于畜禽疾病防治且作為畜禽飼料添加劑的報道較少見,并且僅停留在單方制劑(銀杏葉提取物)這個小范圍內,缺乏在銀杏葉復方制劑方面的深入研究。復方中藥是單味藥物治病的進一步發展,既能發揮單味藥的特長,又能彌補單味藥的不足,更能增強效力。在大力提倡綠色食品的今天,中草藥具有的天然性、毒副作用小、不易產生耐藥性等優勢是抗生素和化學合成藥物所無法比擬的。因此,本試驗在課題組前期研究的基礎上,利用銀杏葉與中草藥(黃芪、白術、黨參、茯苓)配制成銀杏葉復方制劑,通過藥理學試驗,對小鼠腹腔注射利血平復制脾虛證模型小鼠,觀察銀杏葉復方制劑對脾虛小鼠內臟器官發育情況的影響,并結合銀杏葉復方制劑對脾臟、腎臟和肝臟的抗氧化能力進行比較研究,為科學利用我國銀杏葉這一優勢資源、研究一種以銀杏葉為主的中草藥飼料添加劑提供理論依據。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1銀杏葉復方制劑的制備銀杏葉干粉由長沙博健生物科技有限公司提供,產品標準號:Q/ADPG001-2008;黃芪、黨參、白術、茯苓購于福建紫金醫藥連鎖有限公司,質量符合中華人民共和國獸藥典(2005版)標準。上述5種藥物按照質量比為
5∶2∶1∶1∶1的比例混勻,采用水煮醇提的方法,首先分別用8倍、6倍和5倍量水煎煮1 h,混合煎煮液并濃縮至100 mL,再將煎煮液分別用75%和85%的乙醇混合過夜,并調節pH值至7.0左右,去除沉淀后用旋轉蒸發儀濃縮,制得每毫升含1 g生藥的濃縮液。
1.1.2利血平注射液(1 mg/mL)廣東邦民制藥有限公司生產,產品批號080307。
1.1.3試驗動物6周齡KM種小鼠,雌性,體重23~28 g,購于福建醫科大學實驗動物中心。
1.1.4實驗性脾虛證模型小鼠的建立依據中醫脾虛證診斷參考標準,選擇利血平造脾虛模型,使用劑量參考文獻[5]進行。通過動物試驗,以小鼠便溏、食欲減少、消瘦、呆立、群聚、活動明顯減少等明顯脾虛體征為脾虛證模型復制成功,確定小鼠脾虛證模型使用劑量為0.2 mL/kg。
1.2試驗動物分組
KM種小鼠60只,雌性,隨機分為對照組、脾虛模型組和銀杏葉復方組。每組設5個重復,每個重復4只小鼠。對照組給予生理鹽水,分別灌胃(0.3 mL/d)和腹腔注射(0.2 mL/kg);脾虛模型組給予生理鹽水灌胃(0.3 mL/d)和腹腔注射利血平(0.2 mL/kg),于第三天出現與文獻報道相符的癥狀;銀杏葉復方組分別給予銀杏葉復方制劑灌胃(0.3 mL/d)和腹腔注射利血平(0.2 mL/kg)。每天給藥1次,連續14 d。
1.3測定指標與方法
1.3.1小鼠內臟器官指數測定小鼠在結束造模后禁食一夜,于次日上午從每個重復各取1只小鼠,斷頸處死后分別剖取心、肝、肺、脾、腎、胃和小腸,用濾紙吸干血跡并稱重,按以下公式計算內臟器官指數:
內臟器官指數=內臟器官重量/體重×100%。
1.3.2小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織抗氧化性能測定小鼠在結束造模后禁食一夜,于次日上午從每個重復各取一只小鼠,斷頸處死后分別剖取肝臟、脾臟和腎臟,用生理鹽水制成20%的組織勻漿待測。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)含量均用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒測定,試劑配制和操作步驟按說明書進行。
1.4數據處理
采用SPSS 10.0軟件進行One-Way ANOVA分析和Duncan氏多重比較,結果以平均值±標準差(x±s)表示。
2結果與分析
2.1銀杏葉復方制劑對脾虛模型組小鼠內臟器官指數的影響
由表1可見,銀杏葉復方組小鼠胃和腎的器官指數均高于脾虛模型組(P>0.05),但低于對照組(P<0.05);銀杏葉復方組小鼠小腸和脾的指數均顯著高于脾虛模型組(P<0.05),與對照組差異不顯著(P>0.05);脾虛模型組的小鼠肝臟指數顯著高于對照組和銀杏葉復方組(P<0.05),銀杏葉復方組與對照組的小鼠肝臟指數差異不顯著(P>0.05);脾虛模型組的小鼠肺臟指數顯著高于銀杏葉復方組和對照組(P<0.05),銀杏葉復方組的小鼠肺臟指數與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。
2.2銀杏葉復方制劑對脾虛模型組小鼠脾臟、腎臟和肝臟組織抗氧化性能的影響
2.2.1銀杏葉復方制劑對脾虛模型組小鼠脾臟組織抗氧化性能的影響由表2可見,脾虛模型組小鼠脾臟MDA含量極顯著高于對照組(P<0.01),SOD、GSH-Px、T-AOC含量均極顯著低于對照組(P<0.01)。銀杏葉復方組小鼠脾臟MDA含量極顯著低于脾虛模型組(P<0.01),與對照組相比差異不顯著(P>0.05);銀杏葉復方組小鼠脾臟SOD、GSH-Px含量較脾虛模型組有所提高但差異不顯著(P>0.05);銀杏葉復方組小鼠脾臟T-AOC含量較脾虛模型組顯著提高(P<0.05)。
2.2.2銀杏葉復方制劑對脾虛模型組小鼠腎臟組織抗氧化性能的影響由表3可見,脾虛模型組小鼠腎臟MDA含量顯著高于對照組(P<0.05),SOD、GSH-Px含量均低于對照組,但差異不顯著(P>0.05),T-AOC含量顯著低于對照組(P<0.05)。銀杏葉復方組小鼠腎臟MDA含量較脾虛模型組顯著降低(P<0.05),與對照組含量差異不顯著(P>0.05);銀杏葉復方組小鼠腎臟SOD、GSH-Px含量與脾虛模型組和對照組相比差異不顯著(P>0.05),銀杏葉復方組小鼠腎臟T-AOC含量較脾虛模型組顯著提高(P<0.05),與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。
2.2.3銀杏葉復方制劑對脾虛模型組小鼠肝臟組織抗氧化性能的影響由表4可見,脾虛模型組小鼠肝臟MDA含量極顯著高于對照組(P<0.01),SOD、GSH-Px、T-AOC含量均極顯著低于對照組(P<0.01)。銀杏葉復方組小鼠肝臟MDA含量與脾虛模型組相比差異不顯著(P>0.05),SOD和GSH-Px含量較脾虛模型組極顯著提高(P<0.01),T-AOC含量較脾虛模型組也顯著提高(P<0.05)。
3討論
3.1銀杏葉復方制劑對脾虛模型組小鼠內臟器官指數的影響
銀杏葉復方組小鼠小腸和脾的指數均顯著高于脾虛模型組且與對照組差異不顯著,顯示銀杏葉復方制劑有促進脾虛小鼠消化器官和免疫器官發育的作用。肝臟是重要的解毒器官,研究發現脾虛證可導致模型動物的肝壞死、變性[6],本試驗中脾虛模型組的肝臟指數顯著高于對照組和銀杏葉復方組,而銀杏葉復方組與對照組的肝臟指數差異不顯著,一方面可能是利血平導致脾虛模型小鼠肝臟代償性增生的結果,同時與銀杏葉復方制劑促進小鼠肝臟解毒作用有關。脾虛證的影響學研究表明,脾陽虛證肺紋理的主要改變為模糊、紊亂、扭曲、中斷,并有顆粒斑點及網狀陰影[7]。本試驗中脾虛模型組的肺臟指數顯著高于對照組和銀杏葉復方組,器官指數是檢測反應物質可能對臟器有毒性作用的指標之一,試驗結果表明利血平亦可導致脾虛模型小鼠肺代償性增生,銀杏葉復方組的小鼠肺指數與對照組相比差異不顯著,表明銀杏葉復方制劑對脾虛模型小鼠的肺功能有改善作用。
“脾胃”是中醫學上的名稱,一般泛指人體的整個消化系統,其中主要包括胃腸道等重要器官。“脾虛證”是以消化功能低下為主的多器官和多系統功能減弱的綜合病理變化[8],故脾胃內傷是百病由生的主要內容。試驗表明,銀杏葉復方制劑可促進脾虛小鼠脾胃發育和促進肝臟的解毒作用,對脾虛模型小鼠的腎和肺功能亦有改善作用,分析認為銀杏葉復方制劑的這種作用與方中各種有效成分有關。方中銀杏葉性味甘、苦、澀、平,歸心、肺經,有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛之功效;黃芪性味甘、溫,歸肺、脾經,有補氣固表之功效,可促進血清和肝臟蛋白質代謝,同時黃芪中的主要成分——黃芪多糖可改善脾虛小鼠的消化吸收功能[9];黨參,性味甘、平,入脾、肺經,具健脾補肺、益氣生津之功;白術、茯苓二藥均能益氣健脾,白術苦溫而善于燥濕,茯苓甘淡而善于滲濕,合而用之,一燥一濕,健脾除濕,相輔相成,成為古今治療脾氣虛證及脾虛泄瀉的經典小方和常用藥材。中醫五行理論認為心屬火,脾屬土,而火又生土,所以黃芪、黨參、白術、茯苓配以銀杏葉相得益彰。
3.2銀杏葉復方制劑對脾虛模型組小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織抗氧化性能的影響
本試驗采用利血平復制小動物脾虛模型是一種成熟的方法,研究表明脾虛動物存在體內過氧化與抗氧化之間的平衡失調,脾虛證患者的抗氧化酶(GSH-Px、SOD等)活性降低,MDA含量升高[10-12]。試驗中脾虛模型組小鼠肝、脾和腎臟的GSH-Px、SOD的活性均低于對照組,而MDA含量均高于對照組,這表明脾虛模型的復制是成功的。
正常情況下機體抗氧化體系處于動態平衡狀態,但在內外因的作用下這種平衡被破壞,使機體產生過多的氧自由基,氧自由基可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發脂質過氧化反應,從而形成脂質過氧化物,如MDA。MDA的含量可反映機體脂質過氧化物的生成速率和強度,間接反映組織氧化損傷程度。機體對活性氧和自由基的清除主要由SOD、GSH-Px和T-AOC等酶促系統的活性增強來完成。因此,機體抗氧化能力可通過血液中GSH-Px、SOD和T-AOC等指標來體現。試驗中銀杏葉復方組小鼠脾臟、腎臟中MDA含量較脾虛模型組顯著降低,而肝臟組織中SOD和GSH-Px含量較脾虛模型組顯著提高,同時脾臟、腎臟和肝臟T-AOC含量較脾虛模型組顯著提高,提示銀杏葉復方制劑對脾虛小鼠的脾臟、腎臟和肝臟的功能有良好的保護作用。銀杏葉復方制劑對脾虛證小鼠這種良好的預防效果,與方中銀杏葉等各味藥的抗氧化作用有關。本試驗采用水煮醇提法,最大程度地提取了方中各味藥物的有效成分,其中銀杏葉提取物對生物體所產生的活性氧具有很強的清除作用,可以延緩衰老[13];通過補充外源性抗氧化物質或促進機體產生內源性抗氧化物質,有效拮抗自由基對細胞膜的損傷,是一種高效的自由基清除劑[14];同時銀杏葉提取物還可參與調解和提高過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活性,從而加快了自由基的清除[15];黃芪總黃酮是黃芪的主要活性成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤、抗突變等多種生物學功能[16];黨參具有上調抗氧化酶表達作用,能抵抗氧自由基損傷[17];白術和茯苓均有抗氧化、清除自由基的作用[18,19]。上述藥物按一定比例組合,可綜合發揮其良好的抗氧化作用。
綜上所述,銀杏葉復方制劑具有促進脾虛模型小鼠脾胃發育和肝臟解毒的作用,對脾虛模型小鼠的腎和肺功能亦有改善作用。抗氧化試驗表明,銀杏葉復方制劑對脾虛模型小鼠的脾臟、腎臟和肝臟的功能有良好的保護作用。
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