基于DPO引物的多重PCR在檢測單增李斯特菌中的應用

摘要：根據單增李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ和ｉａｐ基因設計了３對常規引物和ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物，采用多重ＰＣＲ的方法，建立了單增李斯特菌的快速檢測體系，并比較了常規引物和ＤＰＯ引物的優劣，結果表明ＤＰＯ引物的特異性強，能夠快速準確地檢測單增李斯特菌。

關鍵詞：單增李斯特菌；ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物；多重ＰＣＲ

中圖分類號：Ｒ３７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3197-04

Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ DPO Primers

ＬＩＵ Ｃｈｕｎ－ｚｈｅｎ１，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｌｏｎｇ２，ＪＩＮＧ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｕ１

（１． Food and Bioengineering School Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｅｎａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ） ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅs， ｈｌｙ， ｐｒｆＡ ａｎｄ ｉａｐ， ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）， ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ 3 pairs of ｒｅｇｕｌａｒ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＰＯ primers ｈａｄ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ primers， could detect L. monocytogenes accurately and quickly．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ； ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ） ｐｒｉｍｅｒｓ； ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ

單核細胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，簡稱單增李斯特菌）是危害公共衛生和食品行業的一種重要人畜共患病致病菌，使人和動物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成孕婦流產、死胎等疾病，病死率很高。它能夠耐受低ｐＨ、高鹽環境，并且能在較寬溫度范圍內生長［１］。近年來，很多的突發病例都與消費的食品被單增李斯特菌污染有關。因此，快速、準確地檢測單增李斯特菌對于預防這些疾病的發生至關重要。目前，ＰＣＲ技術被廣泛應用于單增李斯特菌的檢測。多重ＰＣＲ是在常規ＰＣＲ基礎上改進并發展起來的一種新型ＰＣＲ擴增技術，是在同一反應體系中加入多對引物同時擴增多條目的ＤＮＡ片段的方法［２］，采用這一技術可同時檢測多種病原微生物。多重ＰＣＲ雖為一種特異靈敏、簡便快速、高通量的檢測技術，但如果實驗條件控制不當，很容易導致擴增失敗或非特異性產物［３］；引物的設計及靶序列的選擇不當等都可能降低其靈敏度和特異性。

近年來，一種新興的ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）技術，既可保證擴增的特異性，又可大大提高擴增效率，為多重ＰＣＲ技術的應用提供了新的前景［４］。本研究采用ＤＰＯ技術，建立了多重ＰＣＲ檢測體系，以達到快速準確檢測單增李斯特菌的目的。

１材料與方法

１．１材料與儀器

菌種：單增李斯特菌（ＧＩＭ１．２２８）購于廣東省微生物菌種保藏中心；試劑：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶購于北京百泰克生物技術有限公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ購于寶生物工程有限公司；設備：梯度ＰＣＲ儀（美國ＡＢＩ公司），凝膠成像系統（美國ＵＬＴＲＡ． ＬＵＭ．Ｉｎｃ）。

１．２引物的設計與合成

根據單增李斯特菌的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ、ｉａｐ基因的保守序列［５－７］分別設計３對常規引物以及相應的ＤＰＯ引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體如下（表１）。

１．３實驗方法

１．３．１單增李斯特菌ＤＮＡ的提取Ｃｈｅｌｅｘ－１００法提取單增李斯特菌ＤＮＡ［８］。Ｃｈｅｌｅｘ－１００作為一種離子螯合劑，由苯乙烯和苯二乙烯組成。其懸液在堿性環境（ｐＨ １０～１１）和１００ ℃的條件下，可導致細胞膜的破裂和ＤＮＡ的變性并釋放出來。①取適量細菌到１．５ ｍＬ離心管中，加入５００ μＬ純水，劇烈振蕩，室溫下放置１５ ｍｉｎ。②１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３ ｍｉｎ，去上清，收集沉淀（必要時可用蒸餾水反復洗沉淀物，直至無色或色素很少）。③沉淀中加入２００ μＬ ５％ Ｃｈｅｌｅｘ－１００溶液（使用前充分振搖，使Ｃｈｅｌｅｘ－１００顆粒懸浮），在振蕩器上反復振蕩，５６ ℃保溫３０ ｍｉｎ以上。④取出后振蕩，１００ ℃保溫８ ｍｉｎ，振蕩后１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３ ｍｉｎ，取上清液用于ＰＣＲ擴增，或放４ ℃保存備用。

１．３．２３重ＰＣＲ反應條件的優化以單增李斯特菌ＤＮＡ為模板，分別對常規引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的反應條件進行優化并比較。反應體系為２５ μＬ，包括１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ ２．０ μＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ，３對１０ μｍｏｌ／Ｌ引物各０．５ μＬ，３ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶０．５ μＬ。對ＰＣＲ反應的退火溫度、Ｍｇ２＋濃度、引物濃度等進行優化。

１．３．３ＤＰＯ引物與常規引物的特異性檢測以金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌亞Ⅰ型、金黃色葡萄球菌亞Ⅱ型、沙門氏菌、乙型沙門氏菌、甲型沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、威爾氏李斯特菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌（肉中提取、ＪＭ１０９、ＡＴＣＣ２５９２２、大腸桿菌Ｏ１５７）的ＤＮＡ為模板，分別用３個基因的常規和ＤＰＯ引物進行ＰＣＲ擴增，所得的ＰＣＲ產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

１．３．４ＤＰＯ引物多重ＰＣＲ的靈敏度檢測將單增李斯特菌標準菌株培養至對數期，通過ＬＢ瓊脂平板計數測菌落數。將菌樣分別用超純水進行倍比稀釋，１２ ０００ ｒ/min離心２ ｍｉｎ，采用Ｃｈｅｌｅｘ－１００法抽提ＤＮＡ。ＰＣＲ反應程序為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５８ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸５０ ｓ，３０個循環；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。取ＰＣＲ產物７ μＬ進行瓊脂糖凝膠電泳（６０ Ｖ １ ｈ），照相觀察和分析。

２結果與分析

２．１３重ＰＣＲ反應條件

２．１．１退火溫度對常規引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的退火溫度進行優化，電泳結果見圖１、圖２，兩種引物在５５～５９ ℃之間都能擴增出目的條帶，但ＤＰＯ引物擴增出的條帶亮度更好。

２．１．２Ｍｇ２＋ 濃度對常規引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的Ｍｇ２＋濃度進行優化，電泳結果見圖３、圖４。Ｍｇ２＋濃度較低時，兩種引物都僅能擴增出２條目的條帶；Ｍｇ２＋濃度大于２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ時，ＤＰＯ引物擴增出３條目的條帶，而常規引物擴增出非特異性條帶。由此可見Ｍｇ２＋對ＤＰＯ引物的影響較小，用ＤＰＯ引物擴增時，在較高Ｍｇ２＋濃度條件下也能保證擴增的特異性。此后的反應中，在２５ μＬ ３重ＰＣＲ反應體系中添加Ｍｇ２＋濃度為１．８ ｍｍｏｌ／Ｌ。

２．１．３引物濃度由圖5和圖6可知，不同濃度的常規引物和ＤＰＯ引物都能擴增出３條目的條帶，都有很強的特異性。此后的反應中，在２５ μＬ ３重ＰＣＲ擴增體系中添加３種引物的上下游引物濃度都為２００ ｎｍｏｌ／Ｌ。

２．２ＤＰＯ引物與常規引物特異性比較

對常規引物和ＤＰＯ引物的特異性檢測結果見圖7和圖8。ＤＰＯ引物僅在單增李斯特菌擴增出目的條帶，而常規引物在大腸桿菌（肉中提取）、威爾氏李斯特菌和宋氏志賀氏菌中均有非特異性條帶出現。因此，ＤＰＯ引物的特異性要強于常規引物。

２．３ＤＰＯ引物與常規引物靈敏度的比較

ＬＢ瓊脂平板計數法測得單增李斯特菌的菌體濃度約為１０８ CFU／ｍＬ。將菌液稀釋，分別用常規和ＤＰＯ引物進行３重ＰＣＲ擴增。從圖9、圖10可以看出常規和ＤＰＯ引物擴增單增李斯特菌的檢測靈敏度都為１０７ CFU／ｍＬ，沒有太大差別。ＤＰＯ多重PCR體系中菌體稀釋到１００倍以后就沒有條帶出現，并沒有表現出優勢，這可能與ＤＰＯ引物的結構有關，需要進一步研究。

３結論

ＤＰＯ引物具有特殊的結構，引物自身以及引物之間很少形成二級結構，試驗過程中不需要對引物進行篩選，從而可以簡化操作步驟［９］。ＤＰＯ引物特異性強，與模板發生錯配的幾率很小，一旦有３個以上堿基錯配，就不會成功擴增［１０］。本研究中ＤＰＯ引物與常規引物相比，在退火溫度上沒有表現出很大的優越性，但對Ｍｇ２＋濃度不敏感，在高Ｍｇ２＋濃度下還能保證擴增特異性。

本研究建立的ＤＰＯ多重ＰＣＲ方法可在較短時間內準確地完成對單增李斯特菌的檢測。其與常規引物的對比表明ＤＰＯ引物具有很強的特異性，ＤＰＯ引物的應用可以解決限制多重ＰＣＲ發展的非特異性問題，具有較強的應用價值。

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