兩種貴州地方雞線粒體DＮA控制區全序列分析

摘要：采用ＰＣＲ和直接測序的方法測定興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞線粒體ＤＮＡ控制區全序列，分析比較兩者ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ序列３個區的變異。結果表明，興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞線粒體ＤＮＡ控制區全序列長分別為１ ２３１和１ ２３０ ｂｐ，其中興義矮腳雞ｍｔＤＮＡ控制區的堿基摩爾分數分別為Ａ ２６．９２％、Ｔ ３３．４１％、Ｇ １３．３９％、Ｃ ２６．２９％，長順綠殼蛋雞的分別是Ａ ２７．１３％、Ｔ ３３．５８％、Ｇ １３．２０％、Ｃ ２６．０９％。ｔ檢驗顯示兩種貴州地方雞種間線粒體ＤＮＡ控制區堿基Ａ與Ｃ的含量差異顯著，說明Ａ與Ｃ之間的顛換較多。興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞的遺傳距離是０．０３８ ６，根據分子鐘計算，二者大約在１９３萬年前分歧進化。

關鍵詞：線粒體ＤＮＡ控制區；興義矮腳雞；長順綠殼蛋雞；遺傳變異

中圖分類號：Ｑ３４３．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3114-02

Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Kｉｎｄｓ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｉｃｋｅｎ

ＷＡＮＧ Ｗｅｎ－ｔａｏa，ＣＨＥＮ Ｂｉｎa，ＦＵ Ｚｈｕ－ｙｉｎb

（a． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｌａｔｅａｕ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ；

b． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＰＣＲ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ ｉｎ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ Ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ ｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ． Ｔｈｅ Ｄ－ｌｏｏｐ ｏｆ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ ａｎｄ Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ ｗａｓ

１ ２３１ ａｎｄ １ ２３０ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｌｏｎｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ molar fraction ｏｆ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ ｗａｓ Ａ ２６．９２％， Ｔ ３３．４１％， Ｇ １３．３９％， ａｎｄ Ｃ ２６．２９％ ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ ｗａｓ Ａ ２７．１３％， Ｔ ３３．５８％， Ｇ １３．２０％ ａｎｄ Ｃ ２６．０９％． Ｔｈｅ t－ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａ ａｎｄ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｒｅｅｄｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｂｒｅｅｄｓ ｗａｓ ０．０３８ ６． Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｃｋ， ｔｈｅ ｔｗｏ ｂｒｅｅｄｓ ｄｉｖｅｒｇｅｄ ａｎｄ ｅｖolved ａｂｏｕｔ １．９３ ｍｉｌｌｉｏｎ ｙｅａｒｓ ａｇｏ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ； Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ chicken； Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ； gｅｎｅｔｉｃ vａｒｉａｔｉｏｎ

線粒體ＤＮＡ控制區是非編碼基因區，在進化過程中受環境的選擇壓力小，表現出進化速率快和母系遺傳等特點，在鳥類的分類研究中常用作種系發生的分子標記［１］。

在漫長的家雞養殖歷史中，貴州形成了豐富的地方雞品種資源。興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞是兩種優良的貴州地方雞種，近年來由于生存環境遭到破壞、引進外地品種雜交改良等人為因素以及某些自然因素的影響，二者的開發利用受到限制［２，３］。對二者的親緣關系和起源分化的研究不僅可以弄清它們的親緣關系狀況，為進一步選育和雜交配套提供理論基礎，還可探討人工選擇對同一個地理群體遺傳分化的影響。本研究通過比較興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞兩類群間的ｍｔＤＮＡ序列變異，分析了二者的親緣關系。

１材料與方法

１．１試驗材料

試驗用的興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞各為１５個樣本。翅靜脈采血０．５～１．０ ｍＬ，肝素鈉抗凝，４ ℃保存備用。采用ＴＩＡＮａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ試劑盒提取血樣中ＤＮＡ，－２０ ℃保存備用。興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞均由貴州大學科研雞場提供。

１．２ＰＣＲ反應及測序

ＰＣＲ擴增引物為ＰＨＤＬ（５′－ＡＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＴＴ

ＧＡＡＡＡＧＣ－３′）、ＰＨｌＨ（５′－ＴＴＡＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＧ

ＧＡＡＣＣＡＧ－３′）和Ｌ４００（５′－ＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＣＡ

ＣＣＴＣＡＣＧ－３′）、ＰＨＤＨ（５′－ＣＡＴＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧ

ＴＧＣＣ－３′）（引物名稱末尾字母L、H分別代表輕鏈和重鏈）［４］。２５ μＬ ＰＣＲ反應液中含ＤＮＡ樣品２ μＬ，上下游引物各０．８ μＬ，２×Ｔａq ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ試劑１２．５ μＬ，ｄｄ Ｈ２Ｏ ８．９ μＬ。ＰＣＲ循環參數（３０循環）為９４ ℃預變性３ ｍｉｎ，９４ ℃變性３０ ｓ，６１～６３ ℃復性３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，最后７２ ℃延伸４ ｍｉｎ。用２％瓊脂糖凝膠檢測ＰＣＲ產物。擴增產物經ＴＩＡＮｇｅｌ Ｍｉｄｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ試劑盒回收純化后由北京諾賽基因組研究中心完成測序。

１．３序列分析

利用Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８對原始ＤＮＡ序列進行對位排列，并經人工仔細核查后，利用ＤｎａＳＰ ４．０［５］提取變異位點。利用ＭＥＧＡ ４．０［６］統計堿基組成，并計算基于Ｋｉｍｕｒａ雙參數模型的遺傳距離。以原雞為外群（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＡＢ００７７２０），構建ＮＪ分子系統發生樹。

２結果

２．１ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區序列變異

用Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８對原始ＤＮＡ序列進行對位排列和剪切對齊后，得到興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞線粒體ＤＮＡ控制區序列全長分別為１ ２３１ ｂｐ、１ ２３０ ｂｐ。與興義矮腳雞相比，長順綠殼蛋雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區全序列在第４４６位點缺失。兩者之間共發現 ２３個變異位點，包括１１個轉換和１２個顛換，11個轉換分別是５次Ｔ－Ｃ間轉換，６次Ａ－Ｇ間轉換；顛換中，Ａ－Ｔ間２次，Ｇ－Ｔ間１次，Ａ－Ｃ 間８次，Ｇ－Ｃ間１次。

興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區Ⅰ區有１３個變異位點，占總變異數的５６．５％，序列變異率為４．１１％；Ⅱ區有 ２個變異位點，序列變異率為０．４３％；Ⅲ區有８個變異位點，序列變異率為１．７９％。

２．２ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區序列堿基組成

興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞ｍｔＤＮＡ控制區的堿基含量見表１。由表１可見，兩種貴州地方雞Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ ４種堿基的平均摩爾分數分別為２７．０２％、３３．４９％、１３．２９％、２６．１９％，Ａ＋Ｔ含量高于Ｇ＋Ｃ，這符合雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區是Ａ＋Ｔ富含區、而Ｔ含量最高的特點，表現出ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區堿基組成的偏倚性。ｔ檢驗顯示兩種貴州地方雞種間線粒體ＤＮＡ控制區堿基Ａ與Ｃ的含量差異顯著（Ｐ＜０．０５），說明Ａ與Ｃ之間的顛換較多。

２．３系統發生樹

基于Ｋｉｍｕｒａ雙參數模型計算興義矮腳雞與長順綠殼蛋雞的遺傳距離為０．０３８ ６，兩種貴州地方雞種與原雞的遺傳距離為０．２１０ ６。

依據測定的序列，以原雞為外群，構建興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞的ＮＪ分子系統發生樹（圖１）。興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞在系統樹上各聚成一支，并且各支的置信度很高，特別是種間的置信度達到９９％。

３討論

鳥類ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區的進化速率為每百萬年２％［７，８］，以此計算興義矮腳雞與長順綠殼蛋雞的分歧進化時間約為１９３萬年。但堿基轉換易飽和，因此可用顛換估算二者間的分歧時間。由于沒有貴州地方雞種進化時間參考，我們以石雞和大石雞為參照。兩種雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區全序列的顛換數有１０個，其分歧時間約為１９０萬年［９］，堿基顛換速率為５．２６個／百萬年。興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞間的堿基顛換數為１２個，由此推算二者的分歧時間大約為２２０萬年前，屬于更新世第二次寒冷期［１０］。貴州地處我國西南地區，可能是更新世第二次寒冷期嚴重的山脊冰川作用將二者隔離在不同的低地，最終分歧進化成不同的地方雞種。

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