Ca²⁺對杜仲愈傷組織誘導(dǎo)及增殖效應(yīng)的影響研究

摘要：以杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）幼莖為外植體，進(jìn)行杜仲愈傷組織誘導(dǎo)、增殖實驗。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的Ｃａ２＋進(jìn)行篩選實驗，以確定誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基中的最佳Ｃａ２＋濃度。結(jié)果表明適度增加Ｃａ２＋濃度，可促進(jìn)杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，并能改善愈傷組織的生長狀態(tài)，增加愈傷組織增殖生長量。但若Ｃａ２＋濃度超過１２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，促進(jìn)效果減弱。

關(guān)鍵詞：杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）；Ｃａ２＋；愈傷組織；增殖

中圖分類號：Ｓ５６７．１＋９文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2780-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａ２＋ ｏｎ Ｃａｌｌｕｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ

ＹＵＡＮ Ｙｕｎ－ｘｉａｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｅｉｎａｎ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｉｎａｎ ７１４０００，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２＋ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｃｏｍｍｉａ ｃａｌｌｕｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｒｏｐｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２＋ ｐｌａｙｅｄ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｃｏｍｍｉａ ｃａｌｌｕｓ， ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ． Ｂｕｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｆ Ｃａ２＋ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ higher ｔｈａｎ １２.0 ｍｍｏｌ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ； Ｃａ２＋； ｃａｌｌｕｓ； ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）是杜仲科（Ｅｕｃｏｍｍｉａｃｅａｅ）杜仲屬（Ｅｕｃｏｍｍｉａ）多年生落葉喬木，是我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種、國家二類重點保護(hù)植物，也是名貴的中藥材和提膠工業(yè)原料。杜仲的干燥樹皮含有豐富的生物活性成分，具有補(bǔ)腎、健腰、強(qiáng)筋、壯骨、安胎等功效，可以提高機(jī)體缺氧耐力、改善機(jī)體免疫功能、降低血脂、平衡調(diào)節(jié)血壓，且久服輕身耐老、延年益壽［１］。但杜仲樹生長緩慢、栽培周期長，剝皮對樹的生長有影響，限制了杜仲藥材的產(chǎn)量。曾黎瓊等［２］研究表明，杜仲愈傷組織中含有與葉和皮相同的藥用成分。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得次生代謝產(chǎn)物有望成為大規(guī)模生產(chǎn)杜仲有效藥用成分的主要手段［3］。本實驗通過改變培養(yǎng)基中Ｃａ２＋濃度，篩選適于杜仲愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的Ｃａ２＋濃度，以期進(jìn)一步提高杜仲愈傷組織誘導(dǎo)、增殖率，為大規(guī)模生產(chǎn)杜仲次生代謝產(chǎn)物提供參考。

１材料與方法

１．１材料

以渭南師范學(xué)院校園栽培一年生杜仲嫩枝條為實驗材料。

１．２方法

１．２．１杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)剪取一年生杜仲嫩枝條，放入燒杯中加入適量洗衣粉，在自來水下沖洗２ ｈ左右，再用蒸餾水沖洗５ ｍｉｎ，于超凈工作臺內(nèi)，先用７５％酒精處理３０ ｓ，再用０．１％氯化汞處理１２ ｍｉｎ，然后用無菌水沖洗５～６次，將幼嫩莖段切成１．０～１．５ ｃｍ長作為外植體，每瓶接種３個外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ＭＳ＋１.0 ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．７％瓊脂＋３％蔗糖＋５００ ｍｇ／Ｌ脯氨酸＋３００ ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白＋１％ ＰＶＰ，ｐＨ值６．０，培養(yǎng)基中添加Ｃａ２＋濃度梯度為０、３．０、６．０、９．０、１２．０、１５．０、２０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，每個濃度梯度設(shè)置３個重復(fù)。在（２２±１）℃、光照強(qiáng)度為１ ５００～２ ０００ ｌｘ條件下每天光照１３ ｈ，誘導(dǎo)愈傷組織形成，３周后統(tǒng)計誘導(dǎo)率，并觀察愈傷組織生長狀態(tài)。

１．２．２杜仲愈傷組織的增殖莖段在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)２１ ｄ后，將質(zhì)地相當(dāng)?shù)牡S綠色、較疏松、有光澤、生長旺盛的愈傷組織塊小心切下，繼代于增殖培養(yǎng)基（ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．７％瓊脂＋３％蔗糖＋５００ ｍｇ／Ｌ脯氨酸＋３００ ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白）上，每瓶接種４塊愈傷組織。培養(yǎng)基中添加Ｃａ２＋濃度梯度為０、３．０、６．０、９．０、１２．０、１５．０、２０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，每個濃度梯度設(shè)置３個重復(fù)。在（２２±１）℃、光照度為１ ５００～２ ０００ ｌｘ條件下每天光照１３ ｈ，２０ ｄ后統(tǒng)計愈傷組織生長情況，以愈傷組織相對生長量［（培養(yǎng)后重－培養(yǎng)前重）／培養(yǎng)前重］為指標(biāo)，確定繼代培養(yǎng)基最適Ｃａ２＋濃度。

２結(jié)果與分析

２．１誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ｃａ２＋濃度的篩選

幼嫩莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)４ ｄ開始膨大，１周左右就能在莖接觸培養(yǎng)基的一端看到愈傷組織，培養(yǎng)過程中莖段不斷膨大，２周左右莖段基部開始完全愈傷組織化，質(zhì)地較疏松、顏色淡黃綠、有光澤、生長旺盛（圖１）。從圖２可見，培養(yǎng)基中添加３．０～１２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋時，隨著Ｃａ２＋濃度的提高，杜仲愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)升高的趨勢，添加１２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋時誘導(dǎo)率最高，達(dá)１００％，較不添加Ｃａ２＋的培養(yǎng)基高３３．３３個百分點。當(dāng)Ｃａ２＋濃度提高到１５．０～２０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，愈傷組織誘導(dǎo)率不再增加而呈現(xiàn)下降趨勢，且添加２０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋的培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)率低于不添加Ｃａ２＋的培養(yǎng)基。

２．２Ｃａ２＋對杜仲愈傷組織增殖的影響

適當(dāng)增加增殖培養(yǎng)基中Ｃａ２＋濃度，對杜仲愈傷組織的生長有促進(jìn)作用，相對生長量提高，且愈傷組織生長狀態(tài)也有所改善，變得結(jié)構(gòu)更疏松、富有光澤呈奶油色，生長旺盛，相對生長量大（圖３）。其中以添加１２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋時，相對生長量最高，達(dá)７．７，較對照增長４．３。但當(dāng)Ｃａ２＋濃度增大到１５．０～２０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，杜仲愈傷組織的相對生長量有所下降（圖４）。

３討論

Ｃａ２＋是高等植物體內(nèi)普遍存在的一種信使分子，參與植物體內(nèi)多種生理變化及抗逆境的過程［４－６］。現(xiàn)已知在植物體內(nèi)Ｃａ２＋和鈣調(diào)素參與了許多與激素有關(guān)的生理過程，適當(dāng)濃度Ｃａ２＋處理對胡蘿卜、三葉膠、小麥及水稻等的愈傷組織誘導(dǎo)及增殖有較大的促進(jìn)作用［７－１０］。吳娟子等［１１］研究發(fā)現(xiàn)適度提高Ｃａ２＋濃度，水稻愈傷組織誘導(dǎo)率有增高趨勢，但Ｃａ２＋濃度升高到１００ ｍｍｏｌ／Ｌ時誘導(dǎo)率卻下降。付鳳玲等［１２］研究Ｃａ２＋在玉米愈傷組織繼代及鹽誘導(dǎo)脯氨酸積累中的作用，發(fā)現(xiàn)提高培養(yǎng)基中的Ｃａ２＋濃度，對玉米幼胚胚性愈傷組織的繼代具有明顯促進(jìn)作用，促使鹽脅迫下愈傷組織游離脯氨酸的積累，改善細(xì)胞組織生長狀態(tài)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高Ｃａ２＋濃度可使ＡＢＡ誘導(dǎo)的特異ＲＡＢ ｍＲＮＡ表達(dá)水平提高，對植物體細(xì)胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要的促進(jìn)作用［１３］。本實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加不同濃度的Ｃａ２＋對杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖都有影響。適當(dāng)提高Ｃａ２＋濃度，杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)率、增殖生長量均有增加趨勢，以１２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ時效果最佳，但當(dāng)Ｃａ２＋濃度超過１２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ時促進(jìn)作用減弱，與已報道的實驗結(jié)果一致。對于Ｃａ２＋促進(jìn)不同植物愈傷組織誘導(dǎo)及增殖率的機(jī)理，還有待于進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 李琰，姜在民，唐銳． 杜仲葉片愈傷組織誘導(dǎo)的激素優(yōu)化研究［Ｊ］. 植物研究，２００６，２６（２）：１８２－１８６．

［２］ 曾黎瓊，謝金倫，胡志浩，等． 杜仲愈傷組織與樹皮、新鮮葉片的化學(xué)成分比較［Ｊ］．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，１９９４，７（４）：７７－８０．

［３］ 李琰，董娟娥，姜在民，等． 杜仲愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累動態(tài)研究［Ｊ］. 西北植物學(xué)報，２００４，２４（１１）：２０３３－２０３７．

［４］ 何龍飛，沈振國，劉友良． 鋁脅迫下鈣對小麥液泡膜功能和膜脂組成的影響［Ｊ］． 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，２０００，２３（１）：１０－１３．

［５］ ＢＵＳＨ Ｄ Ｓ． Ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，４６（１）：９５－１２２．

［６］ 利容千，朱英國，孟祥紅． 水稻紅蓮－粵泰不育系花粉與藥隔組織Ｃａ２＋的分布［Ｊ］． 作物學(xué)報，２００１，２７（２）：２３０－２３６．

［７］ ＯＶＥＲＶＯＯＲＤＥ Ｐ Ｊ，ＧＲＩＭＥＳ Ｈ Ｄ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９４，３５（２）：1３５－１４４．

［８］ ＥＴＩＥＮＮＥ Ｈ， ＬＡＲＴＡＵＤ Ｍ， ＣＡＲＲＯＮ Ｍ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓｅｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｍüｌｌ． Ａｒｇ．）［Ｊ］． Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ，１９９７，４８：１２９－１３７．

［９］ 趙潔，周嫦，楊弘遠(yuǎn)． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｚｙｇｏｔｅｓ ａｎｄ ｙｏｕｎｇ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ［Ｊ］． 植物學(xué)報（英文版）， １９９８， ４０（１）：２８－３２．

［１０］ 袁云香，萬志剛，石丹． Ｃａ２＋對水稻Ａｃ／Ｄｓ愈傷組織增殖·分化及生根的影響［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， ２００８， ３６（２７）：１１６５８－１１６５９，１１７６３．

［１１］ 吳娟子，趙潔． 鈣和鈣離子載體Ａ２３１８７對水稻早期胚胎離體發(fā)育的影響［Ｊ］． 武漢植物學(xué)研究，２００３，２１（５）：３７５－３８４．

［１２］ 付鳳玲，李晚忱，潘光堂． 鈣在玉米愈傷組織繼代及鹽誘導(dǎo)脯氨酸積累中的作用［Ｊ］． 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，２００３，１６（１）：４２－４４．

［１３］ ＣＵＩ Ｋ Ｒ， ＸＩＮＧ Ｇ Ｓ，ＺＨＯＵ Ｇ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ，２０００，２２（５）：３４９－３５４．

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