羅默堿的抑菌活性測定

摘要：在室內(nèi)測定了羅默堿對８種植物病原真菌和１１種動物病原細菌的抑菌活性。結(jié)果表明，羅默堿對梨銹病菌、柿角斑病菌、柑橘瘡痂病菌、西瓜枯萎病菌、甘蔗鳳梨病菌、香蕉炭疽病菌、玉米炭疽病菌和梨褐斑病菌８種植物病原真菌的菌絲生長有明顯的抑制作用，質(zhì)量濃度為０．５ ｇ／Ｌ時，７２ ｈ（甘蔗鳳梨病菌為４８ ｈ）的抑菌率分別為１００．００％、７７．４５％、７６．８８％、１００．００％、１００．００％、８５．７１％、１００．００％和５９．２１％；有效中濃度（ＥＣ５０）分別為０．０３７ ８、０．１９５ ６、０．173 2、０．０４４ １、０．２６５ ２、０．２５９ ０、０．０９９ ５和０．３４１ ０ ｇ／Ｌ。羅默堿對蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、藤黃微球菌、傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌的抑菌圈直徑為９．５０～１８．７５ ｍｍ，而對普通變形桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌沒有抑制作用。羅默堿對巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌的最小抑制濃度均為０．３ ｇ／Ｌ，對蠟狀芽孢桿菌的最小抑制濃度為０．７ ｇ／Ｌ，對溶壁微球菌的最小抑制濃度為０．２ ｇ／Ｌ。

關(guān)鍵詞：羅默堿；病原菌；抑菌活性

中圖分類號：Ｓ４８２．２；Ｒ９７８．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2664-04

Inhibitory Activity of Roemerine against Pathogenic Fungi and Bacteria

ＬＩＵ Ｘｉａｏ－ｈｏｎｇａ，ＤＥＮＧ Ｙｅ－ｃｈｅｎｇａ，ＴＡＮＧ Ｈｕａｎｇｂ，ＬＵＯ Ｈａｉ－ｙｕａ，ＮＩＮＧ Ｌｅｉａ

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ａｎｄ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ；ｂ． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ； Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４， Ｇｕａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ８ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ １１ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｈａｒａｅａｎｕｍ Ｓｙｄ，Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋａｋｉ Ｅｌｌ．ｅｔ Ｅｖ，Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ ｆａｗｃｅｔｔｉｉ Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｎｉｖｅｕｍ （Ｅ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ） Ｓｙｎ．ｅｔ Ｈａｎｓ，Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ（ｄｅ Ｓｅｙｎｅｓ） Ｖ． Ｈｏｈｎｅｌ，Ｇｌｏｒｏｓｐｒｉｕｍ ｍｕｓａｒｕｍ Ｃｏｏｋｅｅｔ Ｍａｓｓ，Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ （Ｃｅｓ．） Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｓｅｎｔｉｎａ （Ｆｒ．） Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０．５ ｇ／Ｌ against the 8 fungi ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ １００．００％，７７．４５％，７６．８８％，１００．００％，１００．００％，８５．７１％，１００．００％ ａｎｄ 5９．２１％ ａｆｔｅｒ ７２ ｈ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ （ｗｈｉｌｅ ４８ ｈ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔ． ｐａｒａｄｏｘａ）， ａｎｄ ｔｈｅ ＥＣ５０ ｗｅｒｅ ０．０３７ ８，０．１９５ ６，０．173 2，０．０４４ １，０．２６５ ２，０．２５９ ０，０．０９９ ５ ａｎｄ ０．３４１ ０ ｇ／Ｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｏｆ rｏｅｍｅｒｉｎｅ ｔｏ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｆｒａｎｋｌａｎｄ，Ｂ. ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｄｅ Ｂａｒｙ，Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ） Ｃｏｈｎ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ rｏｓｅｎｂａｃｈ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｃｏｈｎ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ （Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｗａｒｒｅｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｓｈｉｇａ） Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ＆ Ｃｈａｌｍｅｒｓ ｗas ９．５０~１８．７５ ｍｍ． Ｂｕｔ ｉｔ had no ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｈａｕｓｅｒ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ （Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｍｉｇｕｌａ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ｍｉｇｕｌａ） Ｃａｓｌｅｉｌｌｉｉ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ． Ｔｏ Ｂ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ，Ｍ ｌｕｔｅｕｓ，Ｓ． ｔｙｐｈｉ ａｎｄ Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，ｔｈｅ ＭＩＣ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ｗas ａｌｌ ０．３ ｇ／Ｌ． Ｔｏ Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ａｎｄ Ｍ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ， that was ０．７ ｇ／Ｌ ａｎｄ ０．２ ｇ／Ｌ respectively．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ； ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ

羅默堿（Ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ）又叫斑點亞洲罌粟堿、蓮堿、繞袂堿［１，２］，是阿樸菲類異喹啉生物堿。主要存在于荷葉、地不容（廣西地不容、云南地不容等）、凹葉厚樸和黃藤等植物中［３－７］。研究發(fā)現(xiàn)羅默堿能明顯舒張ＮＥ預(yù)收縮的大鼠胸主動脈，是舒張血管的天然活性物質(zhì)［８］，并能明顯抑制Ｈ－哌唑嗪與－受體結(jié)合，是受體的拮抗劑［９，１０］。瞿慶喜等［６］研究發(fā)現(xiàn)羅默堿具有α－葡萄糖苷酶抑制活性。鄧業(yè)成等［１１，１２］報道了廣西地不容中Ｌ－羅默堿對水稻褐飛虱的殺蟲活性及對４種農(nóng)作物病原菌的抑菌活性，說明其在農(nóng)藥領(lǐng)域也有很好的應(yīng)用前景。本研究進一步測定了羅默堿對８種植物病原真菌和１１種動物病原細菌的抑菌活性，旨在為羅默堿的開發(fā)利用提供依據(jù)。

１材料和方法

１．１材料

１．１．１供試藥品供試藥品羅默堿由廣西師范大學(xué)藥用資源與分子藥物化學(xué)教育部重點實驗室合成，包含Ｌ型和Ｄ型兩種構(gòu)型。

１．１．２供試植物病原真菌８種供試植物病原真菌為：梨銹病菌（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｈａｒａｅａｎｕｍ Ｓｙｄ）、柿角斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋａｋｉ Ｅｌｌ．ｅｔ Ｅｖ）、柑橘瘡痂病菌（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ ｆａｗｃｅｔｔｉｉ Ｊｅｎｋｉｎｓ）、西瓜枯萎病菌［Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｎｉｖｅｕｍ （Ｅ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ） Ｓｙｎ．ｅｔ Ｈａｎｓ］、甘蔗鳳梨病菌［Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ （ｄｅ Ｓｅｙｎｅｓ） Ｖ． Ｈｏｈｎｅｌ］、香蕉炭疽病菌（Ｇｌｏｒｏｓｐｒｉｕｍ ｍｕｓａｒｕｍ Ｃｏｏｋｅｅｔ Ｍａｓｓ）、玉米炭疽病菌［Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ （Ｃｅｓ．） Ｗｉｌｓｏｎ］、梨褐斑病菌［Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｓｅｎｔｉｎａ （Ｆｒ．） Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ］。

上述８種植物病原真菌通過從田間采集植物發(fā)病部位，在室內(nèi)用ＰＤＡ培養(yǎng)基分離純化獲得。

１．１．３供試動物病原細菌供試動物病原細菌為：蠟狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｆｒａｎｋｌａｎｄ）、巨大芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｄｅ Ｂａｒｙ）、枯草芽孢桿菌［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ （Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ） Ｃｏｈｎ］、金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ）、溶壁微球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ Ｆｌｅｍｉｎｇ）、藤黃微球菌［Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）Ｃｏｈｎ］、傷寒沙門氏菌［Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）Ｗａｒｒｅｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ］、痢疾志賀氏菌［Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ （Ｓｈｉｇａ） Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ＆ Ｃｈａｌｍｅｒｓ］、普通變形桿菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｈａｕｓｅｒ）、銅綠假單孢菌［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ （Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｍｉｇｕｌａ］、大腸桿菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ｍｉｇｕｌａ） Ｃａｓｌｅｉｌｌｉｉ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ］。

上述１１種動物病原細菌由桂林醫(yī)學(xué)院微生物實驗室提供。

１．２方法

１．２．１對病原真菌菌絲生長的抑制活性測定參考陳年春［１３］的菌絲生長速率法進行測定。將供試菌接種在ＰＤＡ平板培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，備用。用丙酮、無菌水體積比１∶１作為溶媒配制藥液，備用。在潔凈工作臺上，吸取１ ｍＬ藥液（對照組用相應(yīng)的溶媒代替）與熱熔的９ ｍＬ ＰＤＡ培養(yǎng)基混勻，倒入直徑９ ｃｍ的玻璃培養(yǎng)皿中，制成厚薄均勻的含藥培養(yǎng)基。用直徑為０．４ ｃｍ的打孔器在已擴大培養(yǎng)的供試菌落邊緣切取菌餅，將菌餅接入帶藥培養(yǎng)基上，使有菌絲的一面朝下，每皿接３個菌餅，呈品字形分布，每個處理設(shè)３個重復(fù)。置（２７±１）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法測量培養(yǎng)７２ ｈ（甘蔗鳳梨病菌培養(yǎng)４８ ｈ）后的菌落直徑，根據(jù)下式求出抑制率：

抑制率＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）／對照菌落直徑×１００％

測定有效中濃度時，用丙酮和水組成的混合溶劑配制５個以上系列濃度的藥液，測定各個濃度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回歸方程、有效中濃度ＥＣ５０等。

１．２．２對細菌的抑制活性測定參考薛泉宏等［１４］的濾紙片擴散法進行測定。將濾紙剪成直徑６ ｍｍ的圓片，滅菌，備用。在潔凈工作臺上，取一環(huán)已活化的供試細菌菌苔，加到１００ ｍＬ無菌水中，振蕩均勻，制成濃度適宜的菌懸液（濃度１０６～１０７ＣＦＵ／ｍＬ）。吸取０．１ ｍＬ菌懸液，加到直徑 ９ ｃｍ平皿的ＬＢ平板培養(yǎng)基上，涂布均勻，制成帶菌平板。將濾紙片浸入一定濃度的藥液中（濾紙片帶藥量約５ μＬ），然后取出晾干，貼于帶菌平板上，每皿４片，中央設(shè)空白對照（空白對照濾紙片浸入相應(yīng)的溶媒中），每個處理設(shè)６次重復(fù)。３７ ℃下培養(yǎng)２４ ｈ后，測量抑菌圈直徑，并計算其平均直徑。

１．２．３對細菌的最低抑制濃度（ＭＩＣ）測定參考張均田［１５］的試管法測定ＭＩＣ。取１環(huán)已活化的供試細菌，加到２０ ｍＬ肉湯培養(yǎng)基中，３７ ℃條件下振蕩培養(yǎng)１０～１２ ｈ后，吸取２ ｍＬ菌液，加１８ ｍＬ肉湯培養(yǎng)基，稀釋成適宜濃度的菌懸液（１０６～１０７ ＣＦＵ／ｍＬ），備用。將樣品以丙酮、無菌水體積比１∶１為溶媒配制成系列濃度的藥液，備用。無菌條件下，取若干支滅菌帶棉塞的試管，編號，往每支試管加０．９ ｍＬ菌懸液、０．１ ｍＬ藥液，搖勻。取０．９ ｍＬ菌懸液，加入０．１ ｍＬ溶媒，作為陽性對照組，觀察細菌能否正常生長。取０．９ ｍＬ肉湯培養(yǎng)基，加入０．１ ｍＬ藥液，作為陰性對照，觀察肉湯或藥液是否被污染。每個處理設(shè)３次重復(fù)。３７ ℃恒溫培養(yǎng)２４ ｈ后，觀察各試管的渾濁度，以試管中的培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁為有細菌生長的標志，最后一個澄清的培養(yǎng)液濃度為藥液對細菌的ＭＩＣ。

２結(jié)果與分析

２．１羅默堿對８種植物病原真菌的抑菌活性

在室內(nèi)用生長速率法測定了羅默堿對梨銹病菌、柿角斑病菌、柑橘瘡痂病菌、西瓜枯萎病菌、甘蔗鳳梨病菌、香蕉炭疽病菌、玉米炭疽病菌和梨褐斑病菌的抑菌活性，結(jié)果（表１）表明，羅默堿對８種植物病原真菌的生長均有明顯的抑制作用，用０．５ ｇ／Ｌ的藥液處理，７２ ｈ（甘蔗鳳梨病菌為４８ ｈ）的抑菌率分別為１００．００％、７７．４５％、７６．８８％、１００．００％、１００．００％、８５．７１％、１００．００％和５９．２１％。

進一步測定了羅默堿對８種植物病原真菌的毒力，結(jié)果（表２）表明，羅默堿對梨銹病菌、柿角斑病菌、柑橘瘡痂病菌、西瓜枯萎病菌、甘蔗鳳梨病菌、香蕉炭疽病菌、玉米炭疽病菌和梨褐斑病菌的ＥＣ５０ 分別為０．０３７ ８、０．１９５ ６、０．１７３ ２、０．０４４ １、０．２６５ ２、０．２５９ ０、０．０９９ ５和０．３４１ ０ ｇ／Ｌ。對梨銹病菌和西瓜枯萎病菌的毒力明顯高于其他６種菌，相對毒力分別為９．０２和７．７３。

２．２羅默堿對１１種動物病原細菌的抑菌活性

采用濾紙片擴散法測定了羅默堿對１１種動物病原細菌的抑菌活性，結(jié)果（表３）表明，用１．０ ｇ／Ｌ的羅默堿處理，對蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、藤黃微球菌、傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌的抑菌圈直徑為９．５０～１８．７５ ｍｍ，而對普通變形桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌３種革蘭氏陰性菌沒有抑制作用。

２．３羅默堿對１１種動物病原細菌的最小抑制濃度（ＭＩＣ）

采用試管稀釋法，測定羅默堿對１１種病原細菌的ＭＩＣ，結(jié)果（表３）表明，羅默堿對巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌的MIC均為０．３ ｇ／Ｌ，對蠟狀芽孢桿菌的MIC為０．７ ｇ／Ｌ，對溶壁微球菌的MIC為０．２ ｇ／Ｌ，而對普通變形桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的MIC都大于１．０ ｇ／Ｌ。

３討論

從本研究結(jié)果可以看出，羅默堿對８種供試植物病原真菌都有很高的抑菌活性，說明羅默堿有廣譜抗真菌作用，推測可能對其他病原真菌也有活性，值得進一步研究。同時，羅默堿對１１種動物病原細菌中的６種革蘭氏陽性細菌也有很高的抑菌活性，推測羅默堿可能有廣譜抗革蘭氏陽性細菌的作用；但只對５種供試革蘭氏陰性細菌中的２種有抑制活性，說明羅默堿對革蘭氏陽性細菌的活性比陰性細菌的活性范圍更廣，這可能是因為革蘭氏陽性細菌和陰性細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分不同所致。羅默堿是蓮屬植物和千金藤屬植物的活性成分，現(xiàn)在亦可用化學(xué)方法合成。對其結(jié)構(gòu)改型進行深入研究，有可能發(fā)現(xiàn)活性更高的新化合物，可為新農(nóng)（獸）藥的創(chuàng)制提供新的先導(dǎo)化合物。

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