豬傳染性胸膜肺炎的實驗室診斷

摘要：采用生化試驗、間接血凝試驗對送檢的疑似豬傳染性胸膜肺炎病豬的病料及血清進行診斷和藥敏試驗。結果表明，從病豬肺臟中分離到１株疑似胸膜肺炎放線桿菌，其革蘭氏染色為陰性球桿菌，在普通營養瓊脂和麥康凱培養基上不能生長，在ＴＳＡ平板上形成不透明的淡灰色、濕潤、光滑、表面隆起的菌落，血凝試驗為陽性，確定所分離菌為胸膜肺炎放線桿菌。同時對該豬群隨機抽檢１２份血樣，用豬胸膜肺炎間接血凝試劑盒檢測胸膜肺炎抗體，其陽性率為８．３％。藥敏試驗表明，磺胺間甲氧嘧啶鈉和長效痢清為敏感藥物。

關鍵詞：豬胸膜肺炎放線桿菌；細菌分離鑒定；血凝試驗；藥敏試驗

中圖分類號：Ｓ８５８．２８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2694-02

Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ Ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ

ＦAN Ｇｕｏ－ｙｉｎｇ１，ＺHU Ｚｈｏｎｇ－ｋｅ２，ＺHONG Ｈｕａ１，ＣHEN Ｊｕｎ－ｊｉｅ１

（1. Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ， ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

2. Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｈｕａｎｇｈｕａｉ Iｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｚｈｕｍａｄｉａｎ， ４６３０００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｈｅｃｋ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐｉｇｓ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ as ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ （ＰＣＰ） Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ Aｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｉｇ ｌｕｎｇ. Ｉｔ ｗａｓ Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ｉｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ ａｎｄ ＭｃＣｏｎｋｅｙ＇ｓ ａｇａｒ． Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ａｎｄ ｆｏｒｍ ａ ｏｐａｑｕｅ ｏｃｅａｎ ｇｒｅｙ， ｍｏｉｓｔ， ｓｍｏｏｔｈ ｃｏｎｏｌｙ ｗｉｔｈ ｕｐｈｅａｖａｌ ａｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ＴＳＡ ｐｌａｔｅ； ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ． Ｉｔ ｗａｓ confirmed ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ bacterium ｗａｓ Aｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ． １２ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ randomly ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＰ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＰＣＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ８．３％． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｌｆａｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ａｃｔｅｄ Ｌｉｑｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｒｕｇｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Aｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ； ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，ＰＣＰ）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，ＡＰＰ）引起的一種高度傳染性的呼吸系統疾病。該病以急性出血和慢性纖維素性胸膜肺炎為特征，具有較高的發病率和致死率［１］。隨著集約化養豬業的迅猛發展，國家及地區間引種頻繁，導致該病的發病率及死亡率大大提高，耐藥性問題導致的治療失敗，給世界各地的養豬業帶來了極大的經濟損失［２，３］。

本試驗對河南省新鄉市某豬場的發病豬病料進行了細菌分離鑒定、血清學檢測及藥敏試驗，旨在為該病的診斷與治療提供科學依據。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試劑麥康凱瓊脂培養基、普通營養瓊脂培養基、羊鮮血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（ＴＳＡ）、草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石碳酸復紅染液由河南科技學院臨床獸醫學教研室提供；ＡＰＰ間接血凝抗原、標準陽性血清、標準陰性血清、稀釋液由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供；金黃色葡萄球菌由河南科技學院預防獸醫教研室提供；藥敏試驗所用藥物均由河南科技學院獸醫院提供。

１．１．２儀器ＨＨ．Ｂ１１恒溫培養箱（廈門建紅醫療器械廠），７５－２型微量振蕩器（江蘇金壇設備有限公司），ＯＬＹＭＰＵＳ—ＣＨ顯微鏡（Ｊａｐａｎ），ＨＧ１０１－２Ａ電熱鼓風干燥箱（南京實驗儀器廠）。

１．１．３病料河南新鄉市某豬場送檢的疑似病豬病料１０份及病豬血清２份。

１．２方法

１．２．１細菌的分離與培養對病死豬進行病理剖檢，觀察各個器官的病變。無菌采取疑似ＰＣＰ病變肺組織，在ＴＳＡ培養基上接種培養，觀察菌落生長情況，挑取可疑菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢［４］。

１．２．２生化培養特性鑒定將分離到的可疑菌落，分別接種于加入０．０１％ ＮＡＤ的羊鮮血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、普通營養瓊脂平板，于３７ ℃培養２４ ｈ，觀察菌落在各個培養基的生長情況。將可疑菌平行接種布滿整個不含Ｖ因子的普通營養瓊脂培養基，再在其上垂直劃線接種２條金黃色葡萄球菌，３７ ℃培養２４ ｈ，觀察衛星現象。無菌狀態下，用接種針取分離菌純培養物，分別接種于加有０．０１％ＮＡＤ的生化反應管中，置于培養箱中３７ ℃培養２４ ｈ，觀察其生化特性。

１．２．３間接血凝試驗１２份抽檢血清和被檢血樣的處理：將送檢病豬的血樣靜置，析出血清，在使用前置于５６ ℃水浴鍋中滅能３０ ｍｉｎ，４ ℃保存待檢。

ＡＰＰ間接血凝抗原的處理：用滅菌生理鹽水１０ ｍＬ稀釋搖勻，１ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清液，加等量的稀釋液搖勻，置４ ℃冰箱２４ ｈ后使用。將凍干標準陽性血清和標準陰性血清按試劑盒說明使用，混勻后作對照。具體操作步驟參見文獻［５］。

判定標準：“＋＋＋＋”表示１００％血球凝集，紅細胞全部凝集，形成一層均勻的膜，布滿整個孔底；“＋＋＋”表示７５％血球凝集，紅細胞在孔底形成一層薄膜，但面積比前者小；“＋＋”表示５０％血球凝集，紅細胞在孔底形成薄膜凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀；“＋”表示２５％血球凝集，紅細胞在孔底呈稀薄散在少量凝集，孔底有小圓點；“－”表示不凝集，紅細胞全部沉于孔底，邊緣光滑。以出現５０％紅細胞凝集的最高稀釋倍數判定為該血清的凝集價（效價）［６］。

判定條件：在陽性對照血清滴度不低于１∶１２８，陰性對照孔血清除第一孔允許存在前滯現象（＋）外，其余各孔及稀釋液對照孔均為“－”的前提下，對待檢血清進行判定，否則重試。

待檢血清的判定標準：檢測血清抗體效價≥１∶８判為陽性，效價≤１∶４為陰性。

１．２．４藥敏試驗將分離菌在巧克力瓊脂平板上均勻劃線接種，按常規紙片法將藥敏紙片貼在平板上，置于恒溫培養箱２４ ｈ，觀察并測量抑菌圈的大小，判定不同藥物的敏感程度。判定標準：抑菌圈直徑≥２０ ｍｍ為高度敏感（＋＋＋），直徑１０～２０ ｍｍ為中度敏感（＋＋），直徑≤１０ ｍｍ為低度敏感（＋），無抑菌圈為不敏感（－）［７］。

２結果與分析

２．１細菌的分離與培養

在ＴＳＡ平板上形成不透明、淡灰色、濕潤、光滑、表面隆起的菌落，挑取單個可疑菌落鏡檢觀察，有革蘭氏染色呈陰性的小球桿菌。病理剖檢結果：剖檢病豬可見其肺臟表面有纖維素性物質附著，并與胸壁和膈肌粘連，胸腔有黃色積液，心包外膜附著有纖維素性物質，心包積液，頜下淋巴結腫大，肝臟和腎臟未見異常。

２．２生化培養結果

分離菌株在巧克力瓊脂平板上３７ ℃培養２４ ｈ后，形成濕潤、淺灰色隆起、直徑０．５～０．８ ｍｍ的圓形菌落；在麥康凱和普通營養瓊脂平板上不生長；在羊鮮血瓊脂平板上有溶血現象。

在靠近金黃色葡萄球菌的地方，可疑菌生長較多，遠離劃線處則生長較少，表明其對Ｖ因子有依賴性。該菌能發酵葡萄糖、甘露糖、蔗糖、果糖，不能發酵甘露醇，尿素酶試驗呈陽性，產生硫化氫氣體，靛基質試驗呈陰性。

綜合以上試驗結果，可確定該分離菌為胸膜肺炎放線桿菌。

２．３血清學診斷結果

血清學診斷結果表明，被檢病豬的血清抗體效價均大于１∶８，可確定為陽性。抽檢的１２份豬血樣中，血凝效價在１∶８以上的有１份，在１∶８以下的有１１份，其陽性率為8.3%。

２．４藥敏試驗結果

藥敏試驗結果見表１。由表１可以看出，該菌對磺胺間甲氧嘧啶鈉高敏，對長效痢清中敏，對強效頭孢、頭孢噻呋、青霉素鉀、氨芐青霉素、氟苯尼考、阿莫西林等不敏感。

３討論

引起豬呼吸系統疾病的病原較多，有些胸膜肺炎病原還能激發或伴發其他疾病如巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、豬放線桿菌的感染［５］。該病的臨床癥狀缺乏特征性，僅靠纖維素性胸膜炎、胸肺粘連等病變不能準確診斷，ＰＣＰ病例并不一定都表現為纖維素性胸膜肺炎，有的表現為肺部充血、水腫［８］。因此對豬傳染性胸膜肺炎的確診必須依靠恰當的實驗室診斷技術。ＡＰＰ在生長過程中對營養及環境要求較高。ＴＳＡ培養基營養豐富，對于嗜血菌的培養率非常高，現引入到ＡＰＰ的分離培養中，效果很好。同時，因該菌與其他雜菌混合感染的時候，細菌的分離更加困難，建議選取未經用藥的病豬或瀕死豬進行分離，其分離率較高，分離時應嚴格無菌操作，防止雜菌的污染。

本試驗采用血凝試劑盒進行檢測，結果病死豬的ＰＣＰ抗體效價均在１∶８以上，該豬群未進行過免疫，說明該豬群感染了ＡＰＰ。加上各地流行病株的血清型各有差異，沒有通用疫苗進行免疫，目前多數豬場仍以藥物控制作為預防和治療的主要手段，但ＡＰＰ易產生耐藥性，且部分敏感豬在感染后短時間內發生不可逆轉的肺組織病變，因此豬場獸醫應對ＡＰＰ的感染情況有充分的認識，必要時可定期分離病原進行體外藥敏試驗，以便早期進行預防［９］。

參考文獻：

［１］ 吳家強，崔錦鵬， 張秀美， 等． 豬接觸傳染性胸膜肺炎研究進展［Ｊ］． 畜牧與獸醫，２００２，３４（１０）：３６－３９．

［２］ 張立昌．豬傳染性胸膜肺炎研究進展［Ｊ］． 養豬，２００１（１）：４０－４２．

［３］ 陳海平，蔡金洲，張輝，等． 豬嗜血桿菌胸膜肺炎的流行和防制［Ｊ］．養豬，１９９５（１）：３４．

［４］ 陳小玲，楊旭夫，朱士盛．豬傳染性胸膜肺炎的流行現狀和防制措施［Ｊ］．中國獸醫雜志，２００１，３７（７）：３３－３５．

［５］ 姚火春．獸醫微生物實驗指導［Ｍ］．北京：中國農業出版社，２００１． ３０－５０．

［６］ 劉慧芳，劉江梅，余旭平．豬傳染性胸膜肺炎鑒別診斷方法［Ｊ］．上海畜牧獸醫通訊，２００６，２５（５）：５２－５３．

［７］ 蔡寶祥．家畜傳染病學（第三版）［Ｍ］．北京：中國農業出版社，１９９６．１４４－１４５．

［８］ 陸承平．獸醫微生物學（第三版）［Ｍ］．北京：中國農業出版社，２００１．

［９］ 王天有，劉保國，趙恒章．豬傳染病現代診斷與防治技術［Ｍ］．北京：中國農業科學技術出版社，２００５．４０－１７９．

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