狗牙根居群遺傳分化的RAPD擴增片段頻率分析

摘要：狗牙根（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．）不同居群由南向北外部性狀具有廣泛的變異性，為明確其分化的分子基礎，以收集到的２８份狗牙根為材料，用２０個隨機引物（１０ bp）共擴增出３１8個ＲＡＰＤ多態性片段，平均每個引物１５．9個多態位點，在２４個居群中共檢測到了４６個特異性片段；３種類型有８％的多態性片段明顯不同；相似生境或同一地域的居群在一些位點上表現出相似或相同的變化。

關鍵詞：狗牙根（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．）；遺傳分化；ＲＡＰＤ

中圖分類號：Ｓ５４３．９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2706-04

Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ Ｂｙ ＲＡＰＤ Ａｎａｌｙｓｉｓ

ＬIANG Ｙｕｅ－ｘｉａｎｇ１，２，ＬＩＡＮＧ Ｈｕｉ－ｍｉｎ１，ＸＩＡ Ｙａｎｇ３，ＹＡＮ Ｌｉ－ｐｉｎｇ３，ＬＩＵ Ｃｕｉ－ｌａｎ３

（１．Agriculture Department of Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｊuｒｏｎｇ ２１２４００， Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｎｉｎｇｘｉａ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５０００２，Ｃｈｉｎａ；

３．Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｊｉｎａｎ ２５００１４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅｒｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ａｂｕｎｄａｎｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ bｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．） ｆｒｏｍ ｓｏｕｔｈ ｔｏ ｎｏｕｔｈ． Ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， 314 ＲＡＰＤ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ２８ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ bｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ２０ ｐｒｉｍｅｒｓ（10nt）． Ｔｈｅ ｍｅａｎ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｗａｓ １５．7 ｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒ． ４６ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ２４ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ． ８％ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｅｖｉｄｅｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｔｙｐｅｓ． Sｉｍｉｌａｒ ｏｒ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ were represented ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｈａｂｉｔａｔ ｏｎ ｃｅｒｔａｉｎ ｌｏｃｉ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．； ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ； ＲＡＰＤ

植物種群隨地理距離的遺傳分化，在形態、等位酶和ＤＮＡ等不同水平上已被許多研究者發現。最近許多研究發現，在植物種群中，遺傳分化也在較小的地理范圍內發生［１，２］。

狗牙根（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．）是暖季型多年生草皮型草種，屬世界廣布種［３］。生長于不同地理居群的狗牙根，在不同的土壤、水分、溫度等生態因子的作用下，經過長期的適應和進化過程，在生長范圍和習性上有極大的多樣性，居群間產生了不同程度的分化［１，４］。

本項研究以收集到的２８份狗牙根，包括國內不同地方野生和坪用型及國外引進商業品種種質資源（居群）為材料，通過ＲＡＰＤ技術分析居群間引物擴增片段頻率的變化規律及遺傳變異性，并結合葉片形態特征，依據聚類分析劃分的３種類型［５］找出同一類型或相似生境的特異性條帶，為狗牙根的分類研究提供分子水平的參考，并為開展狗牙根分子育種研究奠定基礎。

１ 材料和方法

１．１ 植物材料

供試的２８個狗牙根居群來源地及編號列于表１。其中S１～S１２號、S２２～S２８號為中國普通野生型品種，S１３～S２１號為坪用型品種。

１．２ ＲＡＰＤ分子標記

１．２．１植物基因組ＤＮＡ的提取從種質圃中的２８個狗牙根居群中，每個居群隨機選取１０個單株，混和剪取新鮮幼嫩葉片１０～２０ ｍｇ，用冰壺帶回實驗室流水沖洗干凈，去離子水沖洗３遍，吸水紙吸干水分后用改良的ＣＴＡＢ方法提取總ＤＮＡ［５］。

１．２．２ＲＡＰＤ的ＰＣＲ擴增與檢測ＤＮＡ擴增在ＰＴＣ ＤＮＡ ＥｎｇｉｎｅＴＭ ｓｙｓｔｅｍｓ ＰＣＲ儀上進行，ＰＣＲ反應體系為２０ μＬ，擴增產物在凝膠成像系統中拍照，保存圖片。

１．２．３引物篩選篩選了Ｏｐｒｏｎ公司生產的２２０個１０ ｂｐ的隨機引物，選擇擴增條帶豐富、重復性好的２０個引物進行ＲＡＰＤ試驗，所使用的引物序列見表２。

１．２．４數據分析首先用２個不同生態點的野生狗牙根和一個坪用型狗牙根為材料，篩選合適的引物。在選用的２２０個引物中，最后選取了２０個對所有供試的２８份材料具有多態性且擴增效果重復性好的引物進行ＲＡＰＤ分析，收集０．２５～２．００ ｋｂ范圍內的ＲＡＰＤ數據。記錄時只記錄那些譜帶清晰并在重復試驗中穩定出現的帶，不分強弱，并設對照。每個樣品的擴增條帶按有或無記錄，存在時賦值為１，否則賦值為０。統計多態性位點，計算多態位點比率，并找出同一類型或相似生境的特異性條帶，結合葉片形態特征進行分析。

２結果與分析

２．１不同引物ＲＡＰＤ擴增片段頻率的變化及多態性

２０個引物共擴增出３30個ＲＡＰＤ位點，其中單態位點１２個，多態位點３１8個，總計９６．３6％的位點是多態的，各引物檢測到的ＲＡＰＤ多態位點數在１１～２１之間，平均每個引物可檢測出１５．9個多態位點。２０個引物擴增的多態位點比率都在０．８以上，其中１１個引物的擴增位點全部為多態（表２）。由于ＲＡＰＤ位點是一種顯性標記，通常一條帶代表基因組一個位點的產物，這就意味著對狗牙根基因組的３30個位點進行了檢測。引物OPN2和OPN10的擴增結果見圖1。

２．２各居群ＲＡＰＤ擴增片段頻率的變化

隨機擴增后，有一些ＲＡＰＤ位點的擴增片段頻率在居群間表現出規律性的變化。在１２個單態位點上，狗牙根２８個居群在ＲＡＰＤ圖譜上有共同的擴增片段，分別是ＯＰＮ２－５００，ＯＰＮ１０－５００，ＯＰＮ１４－７５０，ＯＰＮ９－８００，ＯＰＮ１２－８５０，ＯＰＮ１６－１０００，ＯＰＮ１６－７５０，ＯＰＮ１６－５５０，ＯＰＧ１０－１０００，ＯＰＧ１０－７５０，ＯＰＳ１１

－１０００，ＯＰＪ１５－５２０，各居群在這１２個位點上的擴增頻率均為１．０。在統計的３１４個多態位點中，有些是狗牙根不同居群或類型中特有的擴增片段，其擴增片段頻率均為０．８以上，其中一些代表性的差異擴增片段結果列于圖2～4。

由圖2可見，供試的２８個居群中，除了３號、１６號、２３號和２４號居群沒有檢測到特異性擴增片段外，其他２４個居群在４６個不同的位點上均檢測到了特異性擴增片段，占總擴增片段的１3．94％，擴增片段頻率均為１．０的居群有２３個，其他居群在這些位點沒有擴增或擴增頻率很低。有特異性標記的居群占供試居群的８５．７１％。這些結果表明在這些位點上居群之間存在著差異性片段。

依據葉片質地大小不同和聚類分析劃分的３種類型［５］在一些位點上表現出明顯的差異（圖3）。Ｉ型（葉片寬長）在ＯＰＮ２－７８０、ＯＰＮ１０－８００、ＯＰＮ１０－２５０、ＯＰＮ１４－１５５０、ＯＰＮ９－７５０、ＯＰＮ６－５００、ＯＰＧ１０－１４００、ＯＰＧ１０－８５０、ＯＰＳ１２－３５０、ＯＰＳ１９－６８０、ＯＰＪ１５－６５０、ＯＰＪ１８－１１００這１２個位點均有擴增片段，且擴增頻率均大于０．８，而其他２個類型在這些位點擴增頻率很低或沒有擴增；Ⅱ型（葉片細長）在ＯＰＮ１２－１９００、ＯＰＳ１１－７５０、ＯＰＪ１３－７５０、ＯＰＪ１５－９５０這４個位點均有擴增片段，且頻率大于０．８，而另２個居群在這幾個位點擴增頻率很低或沒有；Ⅲ型（葉片寬長中等）在ＯＰＮ１０－２０００、ＯＰＮ１０－１０００、ＯＰＮ９－９５０、ＯＰＮ１２－１８００、ＯＰＮ１６－１５００、ＯＰＮ１６－１０５０、ＯＰＧ１０－５００、ＯＰＳ１３－８５０、ＯＰＪ１３－３８０、ＯＰＪ１５－５５０這１０個位點，也是擴增頻率均大于０．８，而另２個居群在這１０個位點頻率很低或沒有。

生長在相似環境的居群在一些位點上也檢測到了相同或相似的擴增片段（圖4）。ＯＰＮ２－７００、ＯＰＮ１４－８５０、ＯＰＮ８－１２００、ＯＰＮ９－７００、ＯＰＮ９－４００、ＯＰＮ６－１０００這６個位點主要存在于來自廣東的４個野生型居群，擴增頻率均大于０．８；ＯＰＮ１６－２０００位點只在南京的２個野生型居群中存在，擴增頻率均為１．０；ＯＰＮ１５－１６００、ＯＰＳ１３－９００、ＯＰＪ１０－４５０、ＯＰＪ１３－４００、ＯＰＪ１５－５５０、ＯＰＪ１８－６５０這６個位點主要在來自于山東的濟南、章丘、歷城、長清的４個野生型居群中表達，擴增頻率均為１．０；而ＯＰＮ１５－５００、ＯＰＪ１８－３５０、ＯＰＮ１６－１９５０這３個位點只在來自于山東泰安和淄博的２個居群表達，ＯＰＪ１５－９００、ＯＰＧ１０－４５０這２個位點只存在于來自江蘇南京、句容、江寧的５個無性系居群，而其他居群沒有相應擴增或擴增頻率很低。

３討論

狗牙根屬種內營養器官的變異遠比種內生殖器官的特征變異大［６］。劉建秀等［７］指出華東地區狗牙根的外部形態特征與Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ ｖａｒ很相近，兩者均具有粗狀到纖細、灰綠到深綠、染色體從４倍到６倍的種源存在。由于狗牙根屬是一個種類繁多、形態變異復雜，含有二倍體、三倍體、四倍體和六倍體的多年生禾草，無論是從形態學還是細胞學水平上進行的分類都是由幾個形態特征或生理生化特性的基因控制，它們在整個遺傳信息中所占比例很小，所以這些分類都有很大缺陷。ＲＡＰＤ技術通過多個不同的隨機引物給出覆蓋整個基因組的多態性信息，且不受環境因素的影響，能直接從ＤＮＡ分子中檢測出序列的變化，在ＤＮＡ水平上揭示群體的遺傳變異，所以利用ＲＡＰＤ指紋圖譜可以反映種內或種間關系、居群間關系和基因組間的關系［８－１３］。

本試驗所用２８份材料分別來源于國內多個市縣的不同地區，代表了國內野生狗牙根的部分區域，另外也包括少量國外育成品種（主要是三倍體）在國內不同地區交換種植且時間較長，所以遺傳性狀也會發生變異。２０個引物在２８份材料之間均具有多態性，其ＲＡＰＤ擴增的總多態位點比率達９６．３6％，揭示出中國野生狗牙根不同居群間、國外引進品種的不同居群間存在著復雜的遺傳性狀，具有豐富的遺傳多樣性。對于狗牙根基因組ＤＮＡ多態性明顯偏高的特點，可以進一步證實眾多研究者從生態等角度發現的狗牙根種內擁有大量可供遺傳變異選擇的基因型，這些豐富的遺傳變異的存在，正是狗牙根能形成眾多品種的分子基礎。

狗牙根廣泛分布于我國黃河流域及其以南地區，在新疆亦有較廣泛的分布，其種質資源非常豐富，在外部性狀和抗逆性等方面差異也很大。但近年來由于人類的活動使狗牙根居群范圍迅速縮小，所以很難沿著一個土壤梯度集中取樣形成一個漸變群。在此項研究中，相同地域或相似生境居群親緣關系較近，在一些位點上顯現出相同或相似的變化，具有相同的特異性位點，表明相同地域或相似生境的狗牙根之間的遺傳基礎更接近。根據不同居群狗牙根ＲＡＰＤ擴增片段頻率的變化又可以看出狗牙根不同居群間確實存在著差異。

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