玉米19 kD醇溶蛋白啟動子克隆與植物表達載體構建

摘要：從玉米自交系９８０１基因組ＤＮＡ中克隆了玉米19 kD醇溶蛋白基因（ｚｅ１９）啟動子，將其連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上。測序結果表明該序列與已報道序列同源性為９４％，包含ＴＡＴＡｂｏｘ、ＣＡＡＴｂｏｘ啟動子基本元件以及ＧＣＮ４、ｓｋｎ－１、ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ、－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ等參與調節玉米醇溶蛋白表達及活性的順式元件。將克隆的ｚｅ１９啟動子取代質粒ｐＢＩ１２１中的３５ Ｓ啟動子，成功構建了由ｚｅ１９啟動子驅動ｇｕｓ報告基因的植物表達載體ｐＢＩｚｅ１９。利用土壤桿菌介導法將構建好的重組質粒ｐＢＩｚｅ１９轉入煙草中，為進一步研究該啟動子組織特異性表達奠定了基礎。

關鍵詞：ｚｅ１９啟動子；土壤桿菌介導法；植物表達載體

中圖分類號：Ｑ７８５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2775-05

Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ １９ ｋＤ Ｚｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｍａｉｚｅ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ

ＬＩ Ｈｕｉ－ｌｕｎ１，２，ＷＥＩ Ｙａｎ－ｌｉ２，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｍｅｉ２，ＨＵ Ｊｉｎ－ｄｏｎｇ２，ＬＩ Ｊｉ－ｓｈｕｎ２，ＹＡＮＧ Ｈｅ－ｔｏｎｇ２

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｉｂｏ ２５５０４９， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｊｉｎａｎ ２５００１４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ １９ ｋＤ ｚｅｉｎ（ｚｅ１９）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ ９８０１， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１８－Ｔ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈａｒｅｄ ９４％ ｈｏｍｏｌｏgy ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｔｗｏ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ， ＴＡＴＡ ｂｏｘ ａｎｄ ＣＡＡＴ ｂｏｘ， ａｎｄ ｓｅｖｅｒａｌ ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ＧＣＮ４ ｍｏｔｉｆ， sｋｎ－１ ｍｏｔｉｆ， ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ，－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｎｅｃｅｓｓｉｔｙ ｆｏｒ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｚｅｉｎ． Ｂｙ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ３５ Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， ｚｅ１９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ （ｇｕｓ） ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ pＢＩ１２１； ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩｚｅ１９ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ， ｔｈｕｓ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｂｏｕｔ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｚｅ１９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ was laid．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｚｅ１９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ； Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ； ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ

隨著植物基因工程的不斷完善，人們需要目的基因準確高效地在受體植物特定部位表達，但組成型啟動子使基因表達分散而造成目標部位表達量不足，難以滿足要求，因此克隆專一的組織特異性啟動子成為目前植物基因工程研究的重點［１］。玉米醇溶蛋白是玉米種子貯藏蛋白的主要成分，占總蛋白的５０％～６０％。根據醇溶蛋白一級結構的相似性可分為α、β、γ、δ ４種，其中α－醇溶蛋白由２５～５０個基因組成的基因家族編碼，包括１９ ｋＤ和２２ ｋＤ的醇溶蛋白。由于玉米醇溶蛋白基因的表達具有嚴格的時空特異性，在種子發育過程中，其表達嚴格限定在胚乳組織中，一般授粉后１０～１２ ｄ開始表達［２］，因此本實驗從玉米基因組中克隆了１９ ｋＤ醇溶蛋白基因（ｚｅ１９）的啟動子序列，對其結構和功能進行分析，以期構建種子特異性啟動子，為玉米種子生物反應器的研究奠定基礎。

１材料與方法

１．１材料和試劑

玉米自交系９８０１、煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ，ＷＴ）均來自山東省農業科學院高新技術中心。大腸桿菌ＴＯＰ１０、土壤桿菌ＬＢＡ４４０、植物表達載體ｐＢＩ１２１均由山東省科學院中日友好生物技術研究中心保存，克隆載體ｐＭＤ１８－Ｔ、各種限制性內切酶和Ｔ４ ＤＮＡ連接酶購自Ｔａkａrａ公司，其他化學試劑為國產分析純，ＰＣＲ引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

１．２啟動子的ＰＣＲ擴增與克隆

以玉米自交系品種９８０１幼苗為材料，利用ＣＴＡＢ法［３］提取玉米基因組ＤＮＡ。根據Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ等［４］發表的ｚｅ１９啟動子序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ｘ６３６６７），設計一對特異引物Ｐ１：５′ＡＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡ

ＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＣＡ３′（劃線部分為引入的Ｈｉｎ ｄ Ⅲ酶切位點）；Ｐ２：５′ＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＧＴＡＣＡＣＴ

Ａ ３′（劃線部分為引入的Ｂａｍ ＨⅠ酶切位點）。以９８０１玉米基因組ＤＮＡ為模板，擴增該基因起始密碼子上游約１ ４００ ｂｐ的調控序列。ＰＣＲ體系為５０ μＬ，包括１０×Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ Ｐ１ ２ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ Ｐ２ ２ μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰs １．２ μＬ，基因組ＤＮＡ模板 １ μＬ，Ｔａｑ酶 ０．５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３８．３ μＬ。ＰＣＲ反應程序為：９４ ℃預變性，５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５０ ℃退火５０ ｓ，７２ ℃延伸９０ ｓ，３０個循環；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，與克隆載體ｐＭＤ１８－Ｔ在Ｔ４ ＤＮＡ 連接酶作用下１６ ℃保溫過夜，構建重組質粒ｐＭＤ１８－ｚｅ１９。將連接反應產物轉化大腸桿菌ＴＯＰ１０感受態細胞，提取質粒，經ＰＣＲ、酶切鑒定后，將陽性轉化子送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，并保存菌種。

１．３ｚｅ１９－ｇｕｓ融合表達載體的構建

將重組質粒ｐＭＤ１８－ｚｅ１９和ｐＢＩ１２１－ｇｕｓ分別用Ｈｉｎ ｄⅢ和Ｂａｍ ＨⅠ進行雙酶切，在Ｔ４ ＤＮＡ連接酶作用下，１６ ℃連接反應過夜，連接反應產物轉化大腸桿菌ＴOP１０感受態細胞，利用ＰＣＲ及酶切方法篩選陽性轉化子，并進行測序鑒定，得到植物表達載體ｐＢＩ ｚｅ１９－ｇｕｓ，表達載體構建過程如圖１所示。

１．４土壤桿菌介導的煙草轉化

采用液氮凍融法將重組植物表達載體ｐＢＩ ｚｅ１９－ｇｕｓ轉入土壤桿菌ＬＢＡ４４０４中，采用堿裂解法［５］提取重組土壤桿菌的質粒，ＰＣＲ鑒定轉化子。表達載體pＢＩ １２１－ｇｕｓ中ｇｕｓ基因上游含有３５ Ｓ啟動子，因此將其轉入土壤桿菌，作為分析ｚｅ１９啟動子活性時的陽性對照，設計ｇｕｓ部分基因（約５００ ｂｐ）的引物（Ｐ１：５′ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧ３′；Ｐ２：５′ＧＣＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣ３′）對其進行ＰＣＲ鑒定。

挑取土壤桿菌陽性重組子于含抗生素（５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ，５０ ｍｇ／Ｌ Ｓｔｒ）的２ ｍＬ ＹＥＢ液體培養基中，２８ ℃過夜培養，轉接到２０ ｍＬ ＹＥＢ培養基中，２８ ℃繼續培養至ＯＤ６００為０．６左右，用刀片將煙草無菌苗葉片邊緣部分切去并棄中脈，切成約１ ｃｍ２大小作為土壤桿菌侵染外植體，在土壤桿菌菌液中侵染５～１０ ｍｉｎ，其間不斷搖動，侵染后的外植體用無菌濾紙吸干菌液置于ＭＳ分化培養基上（２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ），２８ ℃暗培養２ ｄ，轉入ＭＳ篩選分化培養基（５０ ｍｇ／Ｌ Kａｎ，２００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ，２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）中。２５ ℃光照培養約２周后，將煙草愈傷組織及部分抗性芽轉入新鮮培養基中繼代培養，待抗性芽長至２ ｃｍ左右切下轉入ＭＳ生根培養基（５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ，２００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ，０．５ ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ）中。待根系發育良好進行室內移栽，隨機選取１２株長勢良好的植株提取其葉片總ＤＮＡ，ＰＣＲ和瓊脂糖凝膠電泳檢測其是否含有ｚｅ１９啟動子，并設立陰性對照（野生型煙草基因組ＤＮＡ）、陽性對照（構建的重組質粒ｐＢＩｚｅ１９）。

２結果與分析

２．１ｚｅ１９啟動子的擴增、克隆和序列分析

以玉米自交系９８０１基因組ＤＮＡ為模板，根據所設計的引物進行ＰＣＲ擴增，可特異地擴增到約

１ ４００ ｂｐ的條帶（圖２），與目的片段大小一致。將ｚｅ１９啟動子ＰＣＲ純化產物連接到ｐＭＤ１８－Ｔ上得到重組質粒ｐＭＤ１８－ｚｅ１９，進行Ｈｉｎ ｄⅢ和Ｂａｍ ＨⅠ雙酶切鑒定，可切出大小約１ ４００ ｂｐ的條帶（圖３），與ｚｅ１９啟動子片段大小一致，證明ｚｅ１９ ＰＣＲ產物已連接到ｐＭＤ１８－Ｔ，將重組質粒送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

測序結果表明得到的啟動子長度為１ ４２５ ｂｐ，與報道序列同源性為９４％，其３′末端緊鄰該基因起始密碼子ＡＵＧ，與報道序列相比缺失了２０ ｂｐ，缺失序列位于啟動子的可變區，不屬于保守序列，不同玉米品系之間均有差異［４］；另外整個序列有２２個堿基發生了改變，包括１２個堿基的突變和１０個堿基的插入或缺失。采用Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ啟動子數據庫進行功能預測，結果表明該序列存在２處核心啟動子區域（表１），并且得分較高（總分為１分），初步判斷此克隆序列具有啟動子結構。

為了分析序列差異是否發生在啟動子功能元件和重要調控區域，通過ＰＬＡＣＥ和ＰＬＡＮＴＣＡＲＥ數據庫對啟動子進行順式調控元件分析。發現該序列含有ＴＡＴＡ ｂｏｘ和ＣＡＡＴ ｂｏｘ啟動子核心元件，屬于典型啟動子。該啟動子序列中還具有胚乳表達特異性元件，如ＧＣＮ４、ｓｋｎ－１、ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ、－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ等參與調節玉米醇溶蛋白表達及活性的順式元件（表２）。序列分析結果表明，在ＴＡＴＡ ｂｏｘ和ＣＡＡＴ ｂｏｘ以及ｚｅ１９啟動子調節基因特異表達的調控區域沒有發生堿基的變化。此外，該序列中還發現了調節植物生長發育的一些應激元件，例如光反應元件Ｉ－ｂｏｘ、ＣＡＴＴ－ｍｏｔｉｆ、ＧＴ１－ｍｏｔｉｆ、Ｓｐ１、ＧＡ－ｍｏｔｉｆ、Ｇ－ｂｏｘ、ＧＡＴＡ－ｍｏｔｉｆ、ＧＡＧ－ｍｏｔｉｆ；抗氧化元件ＡＲＥ；抗逆反應順式作用元件ＭＢＳ、ＬＴＲ；代謝調控元件Ｏ２－ｓｉｔｅ等順式元件，這些元件可能在植物的生長發育和器官發育中起重要作用。

２．２含ｚｅ１９啟動子的植物表達載體

構建的植物表達載體ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ經ＰＣＲ擴增得到片段大小約為１ ４００ ｂｐ的產物（圖４），通過

Ｈｉｎ ｄⅢ與Ｂａｍ ＨⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測，也得到大小約為１ ４００ ｂｐ的啟動子片段（圖５），與預期結果相符。表明ｚｅ１９啟動子已插入到表達載體ｐＢＩ１２１中，測序結果也顯示重組表達載體ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ已構建成功。

將重組載體ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ與陽性對照質粒ｐＢＩ１２１－ｇｕｓ通過凍融法轉化土壤桿菌，ＰＣＲ鑒定轉化子。結果表明，在轉ｐＢＩｚｅ１９重組質粒的土壤桿菌中擴增到了約１ ４００ ｂｐ的片段（圖６），說明ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ已經成功轉化土壤桿菌；而在轉ｐＢＩ１２１－ｇｕｓ質粒的土壤桿菌中擴增到了約５００ ｂｐ的ｇｕｓ片段（圖７），表明ｐＢＩ１２１也已經成功轉化土壤桿菌。

２．３轉基因煙草的獲得

煙草葉盤經土壤桿菌侵染１周后，外殖體迅速生長，周圍已經開始形成愈傷組織；而沒有經土壤桿菌侵染的陰性對照，在含相同濃度卡那霉素的篩選培養基上葉盤沒有長大，葉盤周圍也沒有愈傷組織形成（圖８）。

連續繼代培養４～５周以后，外殖體分化出大量的愈傷組織及抗性芽（圖９），結果表明，篩選分化培養基中抗生素和生長素的濃度及其配比可以滿足煙草葉盤選擇分化的需要。將抗性芽轉入生根培養基中，一個月后根系發達（圖１0），可以進行室內移栽。

隨機選取１２株生長良好的植株提取其葉片總ＤＮＡ，以基因組為模板利用ｚｅ１９啟動子的特異引物進行ＰＣＲ擴增，經檢測１２株轉ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ的煙草抗性苗有１０株是陽性植株，轉化率達到８３％，而陰性對照沒有擴增到條帶（圖１1）。

３討論

玉米醇溶蛋白的表達具有嚴格的組織特異性，被嚴格限定在種子胚乳中，是研究組織特異性啟動子的良好材料。根據１９ ｋＤ玉米醇溶蛋白啟動子保守序列，設計特異引物從玉米９８０１自交系中擴增啟動子片段，擴增到長約１ ４００ ｂｐ的片段。將該片段連接克隆載體并測序后，該序列與報道序列同源性為９４％。通過生物信息學方法對該序列進行序列分析和功能預測，該序列具有兩處核心啟動子區域，一個位于轉錄起始位點上游－４９ ｂｐ位置，另一個位于－１ １８９ ｂｐ位置，區域得分分別為０．９２、０．９３，這與Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ等［４］的報道一致。在序列結構上，克隆序列含有ＧＣＮ４、Ｓｋｎ－１、Ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ、－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ等多個種子或胚乳表達特異性調控元件。因此，在理論上，所克隆啟動子序列具有種子特異性啟動子的潛在功能。

實驗選用pＢＩ１２１質粒作為基本載體，用ｚｅ１９置換表達載體ｐＢＩ１２１中的３５ Ｓ啟動子，構建植物表達載體ｐＢＩｚｅ１９，因為質粒ｐＢＩ１２１的３５ Ｓ啟動子下游連接報告基因ｇｕｓ，ｇｕｓ基因在很多植物中沒有內源活性，并且其檢測方法靈敏、快速、穩定、線性好，方便下一步對啟動子表達情況的研究。構建好的表達載體ｐＢＩｚｅ１９可以用于下一步植物轉化和再生，研究啟動子活性，也可以用于其他轉基因植物研究。

玉米醇溶蛋白基因啟動子在外源植物中的表達調控是個很復雜的問題，還需要利用克隆的玉米１９ ｋＤ醇溶蛋白基因啟動子對其表達部位、表達周期以及表達強度進行研究。相對于組成型啟動子而言，種子貯藏蛋白基因啟動子具有很強的組織和發育特異性［１１］，可避免外源基因在轉基因宿主植株中非特異表達所造成的能量負荷和物質浪費［１２］。因此，利用種子特異性的啟動子來啟動外源基因以保證外源基因的高效表達，可用于改良農作物品種和性狀以提高產品質量，目前人們已經開始利用轉基因植物作為新型的生物反應器（Ｂｉｏｒｅａｔｏｒ）來生產有意義的次生代謝物、蛋白質、糖類和脂類等［１３］。

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