L-蘇氨酸發酵種子培養基及培養條件的優化

摘要：采用正交試驗設計對菌株ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１ Ｌ－蘇氨酸發酵的種子培養基進行優化，同時對影響種子生長的條件如種子培養時間、種子液初始ｐＨ值、種子裝液量等進行了研究，最終確定了Ｌ－蘇氨酸發酵的最優種子培養條件。確定了種子培養基的最佳組成為葡萄糖３０ ｇ／Ｌ、硫酸銨３ ｇ／Ｌ、玉米漿４０ ｇ／Ｌ、酵母膏５ ｇ／Ｌ；種子的最佳培養條件為２５０ ｍＬ的三角瓶中裝液量２５ ｍＬ，種子培養基的初始ｐＨ值７．０，培養時間１６ ｈ，接種量１０％。

關鍵詞：Ｌ－蘇氨酸；發酵；種子培養基；培養條件；優化

中圖分類號：ＴＱ４６４．７文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2730-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ＬＩＵ Ｋｅ－ｋｅ１，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ２，ＨＡＮ Ｘｉａｎｇ－ｍｉｎ１， ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ－ｓｈｅｎｇ２，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｚｈｉ２

（１． Faculty of Animal Science Technology，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｔａｉｚｈｏｕ ２２５３００， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｌ－threonine ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｍｉｇｈｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｅｅｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｐＨ， ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｗａｓ ３０ ｇ／Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ， ３ ｇ／Ｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ， ４０ ｇ／Ｌ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ａｎｄ ５ ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ． Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ ２５ ｍＬ ｌｉｑｕｉｄ ｓｅｅｄ ｉｎ ２５０ ｍＬ ｏｆ ｆｌａｓｋ， ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｐＨ ７．０， ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １６ ｈ ａｎｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ １０％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； seed culture medium； culture conditions； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

Ｌ－蘇氨酸是一種必需氨基酸，被廣泛應用于生產食品、醫藥、飼料添加劑等［１］。近年來，隨著人民生活水平的提高和養殖業的迅速發展，蘇氨酸的需求量大增，但是受技術限制，國內蘇氨酸的產量較小，生產工藝和產品質量均不成熟，絕大部分的需求依賴進口［２］。目前，微生物發酵法以其生產成本低、節約資源、環境污染小等優點成為工業化生產蘇氨酸的主要方式。微生物發酵種子培養的目的是在較短的時間內獲得大量健壯活躍的種子，為后續發酵產物的形成打下堅實的基礎，若種子質量異常，會給發酵造成極大的影響［３］。而獲得優良種子的主要因素包括選用合適的種子培養基及良好的種子培養條件。對Ｌ－蘇氨酸生產菌ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１的種子培養基及部分培養條件進行了研究，旨在為Ｌ－蘇氨酸的工業化生產提供理論依據。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株Ｌ－蘇氨酸產生菌ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１為從江蘇畜牧獸醫職業技術學院生物技術實驗室保存的菌株ＷＳ４００６中分離誘變選育得到的菌株，初步鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）。

１．１．２培養基［４］基礎種子培養基：葡萄糖４０ ｇ／Ｌ，硫酸銨４ ｇ／Ｌ，玉米漿３０ ｇ／Ｌ，酵母膏５ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰO４ １ ｇ／Ｌ，ＫＨ２Ｐ０４ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４·７Ｈ２０ ０．２５ ｇ／Ｌ，Ｆｅ２ＳO４·７Ｈ２O ０．０１ ｇ／Ｌ，ＭｎＳO４·Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，ｐＨ ７．０，１１５ ℃滅菌１５ ｍｉｎ。發酵培養基：蔗糖 １００ ｇ／Ｌ，硫酸銨 ２０ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰO４ ０．５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰO４ ０．５ ｇ／Ｌ，ＭｇＳO４·７Ｈ２Ｏ ０．２５ ｇ／Ｌ，玉米漿 ２０ ｇ／Ｌ，Ｆｅ２ＳO４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，

１．２方法

１．２．１種子培養及蘇氨酸發酵①菌體斜面活化：取保藏培養基上保藏的菌種，挑少許菌落接種到制備好的活化培養基斜面上，３０ ℃培養４８ ｈ，使菌株達到最佳生長狀態。②種子培養：在裝有２５ ｍＬ種子培養基的２５０ ｍＬ搖瓶中，接種一環新鮮的活化種子，８層紗布封口，于全溫振蕩器上３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養１４ ｈ。③發酵培養：在裝有２５ ｍＬ發酵培養基的２５０ ｍＬ搖瓶中，以１０％的接種量接種種子培養液，８層紗布封口，置全溫振蕩器上３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養７２ ｈ。④用ｐＨ ６．４～８．０的精密ｐＨ試紙測定ｐＨ值。⑤Ｌ－蘇氨酸產量的測定采用紙層析法［５］。

１．２．２正交試驗優化種子培養基成分種子培養基的組成不同，會導致培養基中的微量元素和其他營養成分含量發生變化，對菌體生長和產物形成的影響很大。選取種子培養基的主要成分葡萄糖（Ａ）、玉米漿（Ｂ）、硫酸銨（Ｃ）、酵母膏（Ｄ）４個因素，每個因素選取３個濃度水平，進行Ｌ９（３４）正交試驗，優化種子培養基，每個試驗組兩次重復，各因素及水平見表１。

１．２．３單因素試驗優化培養條件設置單因素試驗，分別考察種子培養基裝液量、種子接種量、初始ｐＨ值和種齡對菌株產Ｌ－蘇氨酸產量的影響。①種子培養基裝液量：分別取一環新鮮的活化菌種至裝有１５、２０、２５、３０、３５ ｍＬ種子培養基的２５０ ｍＬ三角瓶中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養１６ ｈ后，轉入發酵培養基中搖瓶發酵７２ ｈ后測定Ｌ－蘇氨酸的產量；②種子接種量：將活化菌種接種到試驗①所得的最優種子培養基裝液量下培養１６ ｈ后，分別以６％、８％、１０％、１２％、１４％的接種量接入發酵培養基中發酵７２ ｈ后測定Ｌ－蘇氨酸的產量；③種子液初始ｐＨ值：按照①、②優化后的培養條件，將活化的菌種接種到ｐＨ值分別為６．４、６．７、７．０、７．２、７．５、７．７的種子培養基中培養１６ ｈ后，接入發酵培養基中培養７２ ｈ后測定Ｌ－蘇氨酸的產量。④種齡：取一環新鮮的活化菌種，接種于裝有５０ ｍＬ種子培養基的２５０ ｍＬ三角瓶中，振蕩培養，每隔２ ｈ取樣０．５ ｍＬ，用無菌水稀釋１０倍后，用７２２型紫外分光光度計測定吸光度（ＯＤ５０８nm），以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制種子生長曲線；取一環新鮮的活化菌種，按照①～③所得的條件對活化的菌種進行培養，６～２２ ｈ期間每隔２ ｈ取種子液接種到發酵培養基中，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養７２ ｈ后測定Ｌ－蘇氨酸的產量。

２結果與分析

２．１種子培養基的優化

從表２中極差Ｒ的大小可知，各因素對產酸的影響順序依次是硫酸銨、玉米漿、酵母膏、葡萄糖。硫酸銨是無機氮源，其能被菌體快速利用，以滿足菌體生長繁殖及產物合成的需要，對種子培養基及產物形成的影響最大；玉米漿是制造玉米淀粉的副產物，含有豐富的蛋白質以及其他一些生長因子，在種子培養基中既能夠補充氮源還能提供微生物生長所需的多種營養物質，所以對產物合成影響也較大；酵母膏富含蛋白質、核苷酸、維生素及微量元素等微生物生長所必需的生長元素，對產物的形成有一定的影響；葡萄糖對產物影響最小，在種子培養基中不宜多加，因為高濃度的糖類不僅不能維持菌體生長，反而會起到抑菌或殺菌的作用。

４個因素的最優水平組合為Ａ１Ｂ３Ｃ１Ｄ２，即葡萄糖３０ ｇ／Ｌ，玉米漿４０ ｇ／Ｌ，硫酸銨３ ｇ／Ｌ，酵母膏５ ｇ／Ｌ。由于正交實驗所確定的最佳條件并未包含在正交表的９個試驗中，為了進一步確定試驗結果的可重復性，采用最佳條件進行重復實驗。由表３可知，按照最佳種子培養基的配方所得的平均產酸量為５．７８ ｇ／Ｌ，試驗結果較為理想。

２．２種子培養條件的優化

２．２．１種子培養基裝液量對發酵產酸的影響Ｌ－蘇氨酸發酵屬于好氧發酵，溶解氧對蘇氨酸發酵的影響較大，發酵過程應控制通風，以滿足菌體生長和產酸的需要。在一定溫度下溶氧是裝液比（培養基裝液量／三角瓶體積）和搖瓶轉速的函數［７］，如果搖瓶轉速固定則裝液比就會直接影響到培養基的溶氧情況。本試驗采用固定搖床轉速，考察同一規格三角瓶在不同裝液量情況下菌體的發酵產酸水平。根據試驗結果（圖１），不同的種子培養基裝液量對發酵產酸量的影響比較明顯，在２５０ ｍＬ三角瓶中裝２５ ｍＬ的種子培養基，發酵產酸量最大。

２．２．２種子接種量對發酵產酸的影響由圖２可知，接種量過大或者過小均不利于產酸。大量地接入菌種，縮短了發酵周期，但是會造成培養基中溶氧過少，影響發酵產物形成；接種量過少，培養基中菌體濃度小，也不利于產物形成，當種子液的接種量為１０％時，發酵產酸量最大。

２．２．３種子液初始ｐＨ值對發酵產酸的影響分析圖３可知，種子培養基過酸或過堿，均不利于產物的形成，當種子液的初始ｐＨ值為７．０時，發酵產酸量最大。分析原因可能是因為ｐＨ值的變化會引起各種酶活力的改變，從而對菌體生長和代謝能力產生影響［８］。

２．２．４種齡對發酵產酸的影響一般地，接種的種齡以對數生長期的后期，即培養液中菌濃度接近高峰時較為適宜。種齡短的種子接種后往往會導致前期生長緩慢，整個發酵周期延長，產物開始形成時間推遲。過老的種子雖然菌量較多，但接種后會導致生產能力下降，菌體過早衰退［６］。從種子生長曲線（圖４）可以看出，菌體從４ ｈ開始進入對數期，１８ ｈ以后進入穩定期，因此，種子培養時間不宜超過１８ ｈ。

從圖５可以看出，隨著種子培養時間的延長，發酵產酸量先逐漸提高，到１６ ｈ達到最高產酸量，１６ ｈ以后發酵產酸量逐漸減低。結合種子生長曲線，在１６ ｈ剛好處于種子生長的中后期，這時的菌體數量最多，種子生長最為旺盛，接種這時期的種子發酵產酸量最多。

３結論

本試驗應用正交設計，確定了種子培養基的最佳組成為：葡萄糖３０ ｇ／Ｌ，硫酸銨３ ｇ／Ｌ，玉米漿４０ ｇ／Ｌ，酵母膏５ ｇ／Ｌ；用單因素試驗設計，確定了種子的最佳培養條件：２５０ ｍＬ的三角瓶中裝液量２５ ｍＬ，種子培養基的初始ｐＨ值７．０，接種量１０％，培養時間１６ ｈ。本研究為進一步了解菌種ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１的特性以及提高Ｌ－蘇氨酸的產量提供了參考依據，為蘇氨酸發酵的工業化生產奠定了一定的基礎。

參考文獻：

［１］ 黃金，徐慶陽，陳寧． Ｌ－蘇氨酸的生產方法及研究進展［Ｊ］． 河南工業大學學報（自然科學版），２００７，２８（５）：８８－９２．

［２］ 賈冬舒． 蘇氨酸市場現狀及發展前景［Ｊ］． 飼料廣角，２００６（１）：２８－３０．

［３］ 石天虹，劉雪蘭，劉輝，等．微生物發酵的影響因素及其控制［Ｊ］． 家禽科學，２００５（２）：４５－４８．

［４］ 王揚，張力，李偉星，等． 亞硝基胍誘變選育L－蘇氨酸高產菌的研究［Ｊ］． 貴州農業科學，２０１０（４）：１０７－１０９．

［５］ 解曉鵬．Ｌ－蘇氨酸高產菌的選育［Ｄ］．蘭州：甘肅農業大學，２００９．

［６］ 儲炬，李友榮． 現代工業發酵調控學［Ｍ］． 北京：化學工業出版社，２００２．２６２．

［７］ 陳俊峰． Ｌ－色氨酸高產菌的選育及其發酵條件的優化［Ｄ］．西安：西北大學，２００７．

［８］ 白秀峰． 發酵工藝學［Ｍ］． 北京：中國醫藥科技出版社，２００３．９７．

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