外源砷對土壤微生物數量的影響研究

摘要：通過室內模擬的方法，研究外源砷對土壤微生物數量的影響。結果表明，對經馴化后的無污染土壤而言，低濃度外源砷對異養型微生物的生長有刺激促進作用，隨著濃度的增加又表現為抑制作用；在相同的外源砷濃度下，砷對自養型微生物有更強的抑制作用。微污染土壤中的微生物數量高于受砷嚴重污染區土壤的；而當向其中加入外源砷后，微污染土壤中的微生物數量明顯減少。

關鍵詞：外源砷；土壤；微生物；數量

中圖分類號：Ｘ５３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2636-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ａｒｓｅｎｉｃ ｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ

ＳＯＮＧ Ｗｅｉ－ｆｅｎｇ，ＤＥＮＧ Ｑｉ，ＢＩＮ Ｌｉ－ｙｉｎｇ，ＸＩＯＮＧ Ｒｕ－ｙｉ

（Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０００６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｒｓｅｎｉｃ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａ ｑｕｉｔｅ ｓｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｂｌｅｍ ｉｎ ｓｏｍｅ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ａｒｓｅｎｉｃ （ｔｈｅ ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ０ ｍｇ／ｋｇ，５００ ｍｇ／ｋｇ，１ ０００ ｍｇ／ｋｇ，２ ０００ ｍｇ／ｋｇ） ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａｕｘｏｈｅｔｅｒｔｒｏｐｈｓ ｗａｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｓｅｎｉｃ， ｂｕｔ ｉｔ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｗｈｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｓｅｎｉｃ． Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ａｒｓｅｎｉｃ， ａ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｏｎ ａｕｘｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｓ ｔｈａｎ ｏｎ ａｕｘｏｈｅｔｅｒｔｒｏｐｈｓ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｆ ａｒｓｅｎｉｃ， ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｕｘｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｓ ａｎｄ ａｕｘｏｈｅｔｅｒｔｒｏｐｈｓ ｂｏｔｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ａｒｓｅｎｉｃ； ｓｏｉｌ； ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ； ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ

砷是自然界分布廣泛的元素，其最初來源于土壤母質，主要受火山活動所影響，在地殼中自然含量較低，約為３ ｍｇ／ｋｇ［１］。礦冶是造成高濃度砷污染的主要原因，其操作過程中不可避免地產生含砷污泥，造成二次污染［２］。從２０世紀開始，高濃度砷對地下水的污染就一直危害著全球２１個國家和地區的人們，其中受影響人數最多的國家是孟加拉國，大約有２０萬～２７萬人因飲用受砷污染的水而死于癌癥［３］。在我國局部地區，由礦冶和化工活動造成的土壤砷污染也相當嚴重，有的地區土壤砷濃度高達

５ ０７０ ｍｇ／ｋｇ［４］。砷已被國內外列為優先控制的污染物，土壤的砷污染和防治一直是國際上的研究難點和熱點領域。在土壤中，微生物種類很多，由于它們各自具有不同的生理習性，故能產生各種不同的作用［５］。土壤中微生物生存條件的差異，使得土壤中微生物群落的組成和數量發生相應的變化［６，７］。已有研究發現，在長期受砷污染的土壤中，微生物的生物量顯著下降，一些敏感性種群數量下降或消失，而一些耐砷強的種群則得以生長和繁殖［８］。

微生物群落的組成和數量變化必將影響到土壤的功能，而耐砷菌的大量生長對砷價態和形態的變化也必將產生作用。因此，外源砷對土壤微生物數量影響的研究是一項基礎工作，對于研究砷在土壤中的轉化、遷移具有重要意義。本研究通過室內試驗，研究了外加砷源對土壤微生物相對數量的影響，總結出關于不同濃度的砷促進與抑制土壤中微生物生長的變化規律。現將結果報道如下。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１樣品來源土壤樣品有３個，樣品１來自廣東省肇慶市鼎湖山自然保護區，在自然條件下，該樣品污染少，能減少各種試驗干擾因素，其自然含砷量為４．３８ ｍｇ／ｋｇ。因《土壤環境質量標準》（ＧＢ １５６１８－１９９５）中一級標準規定砷的含量在１５ ｍｇ／ｋｇ以下，所以所取土壤可以視為代表性較強的未受砷污染的土壤。樣品２取自廣東省北部某市受砷嚴重污染的土壤，其周圍只有蜈蚣草得以生存，總砷為

７ ５３２．６３ ｍｇ／ｋｇ，視為受砷嚴重污染土壤。樣品３取樣自距離受砷嚴重污染點２～３ ｋｍ處的茶場，其土壤總砷含量為４５．６８ ｍｇ／ｋｇ，視為受砷微污染土壤。

１．１．２培養基①自養型無機鹽培養基：無機鹽培養基＋酵母０．１ ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３ ０．５ ｇ／Ｌ。用于土壤樣品１的試驗。②異養型無機鹽培養基：無機鹽培養基＋酵母０．５ ｇ／Ｌ、乳酸鈉５ ｍｍｏｌ／Ｌ。用于土壤樣品１、２、３的試驗。③１０％ ＬＢ＋葡萄糖培養基：蛋白胨１．０ ｇ／Ｌ、酵母抽提物０．５ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ ｇ／Ｌ、葡萄糖２．０ ｇ／Ｌ，用于土壤樣品２、３的試驗。

無機鹽培養基：Ｎａ２ＳＯ４·10Ｈ２Ｏ ０．０７ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１０ ｇ／Ｌ，ＫＣｌ ０．０５ ｇ／Ｌ，ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０．０４ ｇ／Ｌ，

ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ ０．０５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．１７ ｇ／Ｌ，瓊脂 ２０ ｇ／Ｌ，微量元素 １ ｍＬ／Ｌ，維生素 ５ ｍＬ／Ｌ。

１．２試驗方法

１．２．１土壤樣品馴化與保存土壤樣品１：挑出石塊和植物殘渣后，研磨過篩，四分法取樣，每份取４００ ｇ，共取４份，分別放置于４個塑料保鮮盒中，其中１份作為空白。另外稱取已研磨成粉末狀的ＮａＡｓＯ２ ２００、４００、８００ ｍｇ各１份分別溶解于１４５ mL去離子水中，分別加到另外３份土樣中，用消毒后的竹筷攪拌使其充分混合，放置于帶蓋的小保鮮盒內，使得土壤含ＮａＡｓＯ２量分別為０、５００、１ ０００、２ ０００ ｍｇ／ｋｇ［９］。存放于實驗室（室溫）進行培養馴化，為期９０ ｄ。期間每隔一周查看土壤情況，若缺水，則及時添加去離子水。土壤樣品２、３：挑出石塊和植物殘渣，研磨過篩，四分法取樣后放置于４ ℃冰箱保存。

１．２．２樣品稀釋液的制備稱取待測樣品１ ｇ，放入裝有９９ ｍＬ去離子水和幾顆小玻璃珠的已滅菌三角燒瓶中，放置于搖床上振蕩培養（室溫、１８０ ｒ／ｍｉｎ）３ ｈ［１０］，使微生物細胞分散；再用移液槍吸取，制成１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７等一系列稀釋菌液。

１．２．３涂抹平板計數法將培養基加熱熔化后倒入無菌平板中，待凝固后編號，每一號碼設置３個重復。然后按無菌操作要求，用移液槍吸取１００ μＬ菌液，對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上。再用涂布棒將菌液均勻涂抹在平板上，每次涂抹時需先將涂布棒灼燒滅菌。將涂抹好的平板倒置放于２８ ℃恒溫培養箱中培養，直至長出菌落后進行計數。將培養皿取出后用細菌計數器進行菌落計數，計算方法為：每克樣品的菌數＝同一稀釋度的菌落平均數×１０×稀釋倍數；每克干土中菌數＝（菌落平均數×稀釋倍數）／干土重×１０。

２結果與分析

２．１外源砷對經馴化后的無污染土壤中的微生物數量影響

試驗中的干土重是通過濕土在１０５ ℃烘箱中烘干后得到的，按ＮａＡｓＯ２濃度遞增順序，添加不同濃度ＮａＡｓＯ２進行馴化的每克濕土壤的干土重分別為０．８０４、０．７５５、０．８８６、０．８２６ ｇ。土壤馴化后，在不同的外源砷濃度下，微生物數量見圖１、圖２。由圖１、圖２可知，每克干土中，自養型微生物在空白對照土壤中的數量最多，為９．３×１０７個；其次為含ＮａＡｓＯ２

２ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有３．３×１０７個；接著是含ＮａＡｓＯ２５００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有２．１×１０７個；含ＮａＡｓＯ２

１ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤最少，為２．５×１０６個。每克干土中異養型微生物的數量最多的是含ＮａＡｓＯ２ ５００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有２．８×１０８個；其次為空白對照土壤，為７．１×１０７個；再者為含ＮａＡｓＯ２ ２ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有５．６×１０７個；最少的是含ＮａＡｓＯ２ １ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，為１．８×１０７個。

對圖１和圖２進行對比發現，未添加外源砷前，自養型微生物和異養型微生物在土壤中的數量相差不大，每克干土中分別有９．３×１０７、７．１×１０７個。但當加入不同濃度的外源砷后，砷對自養型微生物有明顯地抑制作用。３個濃度梯度下的自養型微生物數量均低于異養型的，反映出砷對自養型微生物的抑制作用大于其對異養型微生物的作用，從另一個側面也說明異養型微生物的抗砷能力更強。此外，異養型微生物數量在外源砷添加濃度為５００ ｍｇ／ｋｇ時出現了明顯的增加，這表明低濃度砷對異養型微生物生長有刺激促進作用，隨著濃度的增加，又表現為抑制作用。在相同的外源砷濃度下，砷對自養型微生物有更強的抑制作用。但無論是自養型還是異養型，在砷的抑制作用下，微生物數量均表現為先減少后增加的趨勢，這說明不適應砷的微生物先大量減少或滅絕；當外源砷的濃度達到

２ ０００ ｍｇ／ｋｇ時，能適應環境存活下來的耐砷菌便開始大量繁殖，表現為微生物數量的增加。

２．２外加砷對已受砷污染土壤的微生物數量的影響

由圖３可知，在無砷的有機培養基中，微污染土壤的微生物數量高于受砷嚴重污染區土壤的。而當向其中加入外源砷后，微污染土壤的微生物數量明顯減少；而長期在高濃度砷土壤中的微生物數量卻不減反增。

在研究外源砷對未受砷污染土壤中的微生物數量影響的同時，也對受砷污染土壤的樣品進行調查。這種調查除了可以反映調查土壤的微生物數量受砷濃度影響而變化外，還可以和未受砷污染土壤的微生物數量的變化作對比。在無砷的有機培養基中，受砷嚴重污染的土壤中微生物數量比微污染土壤中的要少，這是由于受砷嚴重污染的土壤中，砷抑制了某些微生物的生長和繁殖，而離污染區２～３ ｋｍ處的茶場土壤受砷污染較少，因此不抗（耐）砷的微生物則能生長。隨著外源砷的加入，微污染土壤的微生物數量急劇下降，這是因為茶場土壤的微生物在遇到含砷的培養基，特別是含砷較高的培養基時，出現大量死亡或生長不起來，因此數量大大下降；而含高濃度砷土壤中的微生物數量卻不降反升，這是因為受砷嚴重污染區土壤中本身含有大量的抗（耐）砷菌，砷成為抗砷菌生長所必需的元素，因此微生物的數量大大增加。

３結論

在不同的砷濃度下，砷在３種土壤中對微生物的生長既有促進作用，也有抑制作用；主要表現為土壤中微生物的數量會隨著砷濃度的變化而變化。在砷的抑制作用下，隨著砷濃度的增加，微生物數量均表現為先減少后增加；不適應砷的微生物首先大量減少或滅絕，而后當土壤中的砷濃度達到某一較高濃度后，能適應環境存活下來的耐砷菌便開始大量繁殖，表現為微生物數量的增加。

外源砷對土壤微生物數量影響的研究只是一項基礎工作，后續的工作包括：結合砷對土壤中微生物數量的影響規律，利用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ手段進一步探討其對微生物種群結構的影響，篩選出具有抗砷、耐砷能力的菌種；分別在不同的外源砷濃度下，研究砷對土壤中的自養、異養型微生物的促進和抑制機制；將微生物、植物修復兩者結合起來，在兩者的協同作用下，研究砷的降解與吸收特性及兩者的協同機制。這些工作還需要進行進一步的深入研究。

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