PCR-RFLP法快速測定種豬氟烷基因型及其使用優(yōu)點(diǎn)

祁永旺，王昕陟*，侯 華，張 翠，王金旭

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110161；2.沈陽市畜牧獸醫(yī)研究所，沈陽 110034）

近年來，我國各大種豬場在對現(xiàn)有種豬選育的基礎(chǔ)上，相繼從國外引進(jìn)大批長白、大約克和杜洛克等優(yōu)良種豬。為了檢驗(yàn)評定種豬的性能水平，促進(jìn)各場加強(qiáng)種豬選育工作，開展了大量的種豬性能測定工作。測定性狀主要為胴體品質(zhì)和飼料效率，尚未見將豬的氟烷應(yīng)激敏感基因的檢測納入種豬性能測定的常規(guī)指標(biāo)中。豬的氟烷基因是一種應(yīng)激基因，攜帶該基因的豬易發(fā)生應(yīng)激綜合征。豬應(yīng)激綜合征是指豬在應(yīng)激因子（如驅(qū)趕、運(yùn)輸、防疫注射、配種、受驚嚇等）的應(yīng)激下，發(fā)生惡性、高熱綜合征，表現(xiàn)為呼吸急促、心跳加快、肌肉僵直、后肢呈現(xiàn)痙攣性收縮等，甚至突然死亡，產(chǎn)生PSE，其是由氟烷基因變異引起的。研究發(fā)現(xiàn)正常豬與應(yīng)激豬骨骼肌的蘭尼定受體（RYR1）經(jīng)胰蛋白酶消化后的帶型不同，表明正常豬與應(yīng)激敏感豬之間的氨基酸發(fā)生了置換[1－4]。當(dāng)應(yīng)激因子作用時(shí)，Ca2+大量非正式釋放，電解質(zhì)代謝紊亂引起肌肉持續(xù)收縮，使豬產(chǎn)生惡性高熱，大量析出的Ca2+激活過量的糖元酵解，引起肌肉pH的異常變化，導(dǎo)致劣質(zhì)豬肉（PSE肉）產(chǎn)生，氟烷基因是由常染色體上的單隱形基因控制的一種遺傳疾病，存在于外來種豬和外來種豬與地方豬雜交而育成的品種品系中[5－10]。其中高瘦肉率的種豬，皮特蘭的氟烷基因陽性純合子頻率較高，易造成皮質(zhì)下降，產(chǎn)生PSE肉，給世界各地的養(yǎng)豬生產(chǎn)、豬肉加工和銷售造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是制約現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一個重要因素。及早準(zhǔn)確地對豬群進(jìn)行氟烷基因檢測具有重要作用，因此，本試驗(yàn)從豬主中提取DNA，用特異引物進(jìn)行PCRRFLP擴(kuò)增法對種豬進(jìn)行氟烷基因檢測。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動物及毛樣的采集

長白、大約克及杜洛克種豬購自沈陽市畜牧獸醫(yī)研究所種豬場。自豬只背部逆毛向采集帶毛囊豬毛10～15根，置于裝有滅菌生理鹽水的離心管中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)儀器及試劑

低溫冰箱為中科美菱生產(chǎn)，高速冷凍離心機(jī)為KOKUSAN生產(chǎn)，微量移液器、電泳槽、電泳儀均購自北京市六一儀器廠，PCR儀為北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)，紫外透射儀為上海精科生產(chǎn)，WFH－202紫外透射儀、成像儀均由上海精科生產(chǎn)。PCR擴(kuò)增試劑盒、Taq聚合酶、限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、蛋白酶K均購自大連寶生物公司，引物由大連寶生物公司合成，瓊脂糖凝膠購自美國生命技術(shù)公司，TE溶液、10%SDS（十二烷基硫酸鈉）、飽和酚、氯仿、異戊醇、三蒸水為國產(chǎn)試劑等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 DNA提取

2.1.1 樣品處理

將樣品用三蒸水將表面洗凈，選擇5根毛囊完整的豬毛從根部剪取0.3～0.5 cm置于1.5mL EP管內(nèi)，向EP管內(nèi)加三蒸水500μL。12 000 rpm離心10min，棄上層水，將殘余的水吸凈后開始消化。

2.1.2 消化

加入裂解液400μL將離心后的組織懸浮，再加入10%SDS 200μL和蛋白酶K 10μL，56℃水浴消化過夜（12～14 h）。取出水浴混合液，12 000 rpm離心4min，取上層至1.5mLEP管內(nèi)。

2.1.3 提取

分別加入等體積的飽和酚、氯仿和異戊醇（25∶24∶1），混勻 10min。4 ℃ 12 000 rpm 離心 10min。取上層移至另一EP管，重復(fù)2次。

2.1.4 棄上清

DNA沉淀用75%的乙醇（－20℃預(yù)冷）漂洗，12 000 rpm 4℃離心10min，重復(fù)2次。棄上清，自然干燥（或者超凈臺內(nèi)風(fēng)干）后用50～100μL超純水（或TE緩沖液）溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5 DNA模板的檢測

取DNA溶液5μL，加1μL的DL 2000 Marker，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130 V）約40min，染色10min，在凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像。

2.2 PCR擴(kuò)增

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

引物A、B序列：引物A 5′ TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA 3′；引物B 5′ ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG 3′[5]。

2.2.2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 豬氟烷基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件為35個循環(huán)，預(yù)變性94℃5min，進(jìn)入循環(huán)94℃45 s，56℃50 s，72℃50 s，72℃延伸10min。

2.2.3 PCR產(chǎn)物檢測及酶切

取PCR產(chǎn)物5μL加DL 2 000Marker 1μL進(jìn)行點(diǎn)樣。1%瓊脂糖凝膠電泳（130 v）40min后，將凝膠取出，EB染色后，在紫外燈下觀察結(jié)果，并在凝膠成像系統(tǒng)上照相，保存電泳圖譜。

取PCR產(chǎn)物10μL，加入Hha I內(nèi)切酶（10 U·μL－1）0.4 μL 和 10×Buffer 2 μL，加超純水至 20 μL，37℃恒溫4 h，全部產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（130 v）40min，EB染色10min，在凝膠成像系統(tǒng)儀上觀察結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 氟烷基因型檢測結(jié)果

沈陽畜牧獸醫(yī)研究所種豬場種豬的氟烷基因型檢測結(jié)果見表2。

表2 不同種豬的氟烷基因型檢測結(jié)果

由表2可見，在各品種中均沒有發(fā)現(xiàn)氟烷基因陽性純合子（HaLnn）；而雜合子（HaLNn）在長白豬中有6頭，HaLn基因頻率為7.5%，在大約克夏豬中有2頭，HaLn基因頻率為2.1%，杜洛克豬中有1頭，HaLn基因頻率為2.0%，3個品種中杜洛克豬HaLn基因頻率最低。

3.2 氟烷基因PCR產(chǎn)物HhaI酶切結(jié)果

氟烷基因PCR產(chǎn)物HhaI酶切結(jié)果見附圖。

附圖 氟烷基因PCR產(chǎn)物HhaI酶切結(jié)果

4 討論

M—2000 bp的DNAmarker；1、2、3—NN型；4—Nn型

4.1 豬毛中DNA樣品的制備

以純化的DNA作為模板，在一定范圍內(nèi)增加模板的量可以提高擴(kuò)增產(chǎn)物的量。本試驗(yàn)中隨著豬毛根數(shù)的增加，PCR產(chǎn)物也隨著增加。以4～6根時(shí)效果最好，7根以后擴(kuò)增產(chǎn)物的量開始下降。有研究表明，當(dāng)細(xì)胞數(shù)增加到600時(shí)，PCR產(chǎn)物量并不增加到4 800，PCR產(chǎn)物量則開始下降，這是由于DNA鏈附近大量細(xì)胞碎片使PCR反應(yīng)受到了一定的抑制。其次，設(shè)計(jì)反應(yīng)體系的關(guān)鍵是既能使DNA得到抽提，而又不破壞Taq酶的活性。在DNA抽提過程中通常用蛋白酶溶解細(xì)胞成分和蛋白，蛋白酶的活性受熱易失活，不會影響DNA的抽提，而與DNA結(jié)合緊密的粗蛋白，Taq酶卻不受低熱和無毒性試劑的影響，確保了Taq酶的活性。

4.2 PCR－RFLP分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶HhaI酶切后，基因未發(fā)生突變時(shí)，內(nèi)切酶HhaI可將PCR擴(kuò)增的特異片段酶切成493 bp和166 bp兩條帶，則可判定基因型為NN。當(dāng)氟烷基因兩個位點(diǎn)都發(fā)生突變（C1843→T1843）時(shí)，HhaI限制內(nèi)切酶識別位點(diǎn)消失，659 bp擴(kuò)增的片段不能被酶切消化，電泳后只有一條帶，基因型為nn。當(dāng)一個氟烷等位基因發(fā)生突變（C1843→T1843），而另一個正常，用HhaI酶切可以觀察到659 bp、493 bp和166 bp 3條帶，其基因型為Nn。

5 結(jié)論

豬應(yīng)激綜合征檢測的傳統(tǒng)方法是用氟烷麻醉法，但該方法不能識別雜合子和陰性豬，且操作誤差較大。而通過提取DNA利用PCR－RLFP進(jìn)行檢測，可以100%地檢測出純合子和雜合子，這樣就克服了用氟烷檢測費(fèi)時(shí)、費(fèi)力而且不能測出雜合子的弊端。用血樣和毛囊均能提取DNA，血樣中DNA純度更高，便于擴(kuò)增但血樣的采集要保定豬只，通常體重在30 kg以內(nèi)的仔豬采用該法，對成年豬由于體重原因往往僅采用毛囊提取DNA。通過對種豬場的長白、大約克和杜洛克的檢測發(fā)現(xiàn)，由于高瘦肉率種豬的大量引進(jìn)使種豬群中氟烷基因頻率明顯增高，長白、大約克和杜洛克豬群都含有一定比例的氟烷應(yīng)激基因。

種豬的遺傳改良是豬群生產(chǎn)性能改良的基礎(chǔ)，而種豬性能測定制度是豬遺傳改良的重要技術(shù)措施和保證條件，因此，在種豬性能測定中，除使用現(xiàn)有的生長發(fā)育性能測定和外貌選擇外，還要從種豬分子遺傳結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行性能測定，特別是對氟烷基因型的檢測。張金玲等通過PCR－RFLP技術(shù)對嘉興地區(qū)部分豬場新嘉興黑豬血樣進(jìn)行氟烷基因檢測，結(jié)果表明，37頭新嘉興黑豬基因型均為NN，未出現(xiàn)Nn和nn基因型[11]。及早進(jìn)行檢測具有可以及時(shí)淘汰隱性純合子個體、在父母代選配上避開雜合子公豬和雜合子母豬的選配、在后備豬群中控制氟烷基因的存在。

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