PCR-RFLP法快速測定種豬氟烷基因型及其使用優點

祁永旺，王昕陟*，侯 華，張 翠，王金旭

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110161；2.沈陽市畜牧獸醫研究所，沈陽 110034）

近年來，我國各大種豬場在對現有種豬選育的基礎上，相繼從國外引進大批長白、大約克和杜洛克等優良種豬。為了檢驗評定種豬的性能水平，促進各場加強種豬選育工作，開展了大量的種豬性能測定工作。測定性狀主要為胴體品質和飼料效率，尚未見將豬的氟烷應激敏感基因的檢測納入種豬性能測定的常規指標中。豬的氟烷基因是一種應激基因，攜帶該基因的豬易發生應激綜合征。豬應激綜合征是指豬在應激因子（如驅趕、運輸、防疫注射、配種、受驚嚇等）的應激下，發生惡性、高熱綜合征，表現為呼吸急促、心跳加快、肌肉僵直、后肢呈現痙攣性收縮等，甚至突然死亡，產生PSE，其是由氟烷基因變異引起的。研究發現正常豬與應激豬骨骼肌的蘭尼定受體（RYR1）經胰蛋白酶消化后的帶型不同，表明正常豬與應激敏感豬之間的氨基酸發生了置換[1－4]。當應激因子作用時，Ca2+大量非正式釋放，電解質代謝紊亂引起肌肉持續收縮，使豬產生惡性高熱，大量析出的Ca2+激活過量的糖元酵解，引起肌肉pH的異常變化，導致劣質豬肉（PSE肉）產生，氟烷基因是由常染色體上的單隱形基因控制的一種遺傳疾病，存在于外來種豬和外來種豬與地方豬雜交而育成的品種品系中[5－10]。其中高瘦肉率的種豬，皮特蘭的氟烷基因陽性純合子頻率較高，易造成皮質下降，產生PSE肉，給世界各地的養豬生產、豬肉加工和銷售造成巨大的經濟損失，是制約現代養豬業經濟發展的一個重要因素。及早準確地對豬群進行氟烷基因檢測具有重要作用，因此，本試驗從豬主中提取DNA，用特異引物進行PCRRFLP擴增法對種豬進行氟烷基因檢測。

1 試驗材料

1.1 試驗動物及毛樣的采集

長白、大約克及杜洛克種豬購自沈陽市畜牧獸醫研究所種豬場。自豬只背部逆毛向采集帶毛囊豬毛10～15根，置于裝有滅菌生理鹽水的離心管中，－20℃保存備用。

1.2 試驗儀器及試劑

低溫冰箱為中科美菱生產，高速冷凍離心機為KOKUSAN生產，微量移液器、電泳槽、電泳儀均購自北京市六一儀器廠，PCR儀為北京東迅天地醫療儀器有限公司生產，紫外透射儀為上海精科生產，WFH－202紫外透射儀、成像儀均由上海精科生產。PCR擴增試劑盒、Taq聚合酶、限制性內切酶HhaⅠ、蛋白酶K均購自大連寶生物公司，引物由大連寶生物公司合成，瓊脂糖凝膠購自美國生命技術公司，TE溶液、10%SDS（十二烷基硫酸鈉）、飽和酚、氯仿、異戊醇、三蒸水為國產試劑等。

2 試驗方法

2.1 DNA提取

2.1.1 樣品處理

將樣品用三蒸水將表面洗凈，選擇5根毛囊完整的豬毛從根部剪取0.3～0.5 cm置于1.5mL EP管內，向EP管內加三蒸水500μL。12 000 rpm離心10min，棄上層水，將殘余的水吸凈后開始消化。

2.1.2 消化

加入裂解液400μL將離心后的組織懸浮，再加入10%SDS 200μL和蛋白酶K 10μL，56℃水浴消化過夜（12～14 h）。取出水浴混合液，12 000 rpm離心4min，取上層至1.5mLEP管內。

2.1.3 提取

分別加入等體積的飽和酚、氯仿和異戊醇（25∶24∶1），混勻 10min。4 ℃ 12 000 rpm 離心 10min。取上層移至另一EP管，重復2次。

2.1.4 棄上清

DNA沉淀用75%的乙醇（－20℃預冷）漂洗，12 000 rpm 4℃離心10min，重復2次。棄上清，自然干燥（或者超凈臺內風干）后用50～100μL超純水（或TE緩沖液）溶解，－20℃保存備用。

2.1.5 DNA模板的檢測

取DNA溶液5μL，加1μL的DL 2000 Marker，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130 V）約40min，染色10min，在凝膠成像系統中掃描成像。

2.2 PCR擴增

2.2.1 引物設計

引物A、B序列：引物A 5′ TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA 3′；引物B 5′ ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG 3′[5]。

2.2.2 PCR反應體系

PCR反應體系見表1。

表1 豬氟烷基因PCR擴增反應體系

PCR反應條件為35個循環，預變性94℃5min，進入循環94℃45 s，56℃50 s，72℃50 s，72℃延伸10min。

2.2.3 PCR產物檢測及酶切

取PCR產物5μL加DL 2 000Marker 1μL進行點樣。1%瓊脂糖凝膠電泳（130 v）40min后，將凝膠取出，EB染色后，在紫外燈下觀察結果，并在凝膠成像系統上照相，保存電泳圖譜。

取PCR產物10μL，加入Hha I內切酶（10 U·μL－1）0.4 μL 和 10×Buffer 2 μL，加超純水至 20 μL，37℃恒溫4 h，全部產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（130 v）40min，EB染色10min，在凝膠成像系統儀上觀察結果。

3 試驗結果

3.1 氟烷基因型檢測結果

沈陽畜牧獸醫研究所種豬場種豬的氟烷基因型檢測結果見表2。

表2 不同種豬的氟烷基因型檢測結果

由表2可見，在各品種中均沒有發現氟烷基因陽性純合子（HaLnn）；而雜合子（HaLNn）在長白豬中有6頭，HaLn基因頻率為7.5%，在大約克夏豬中有2頭，HaLn基因頻率為2.1%，杜洛克豬中有1頭，HaLn基因頻率為2.0%，3個品種中杜洛克豬HaLn基因頻率最低。

3.2 氟烷基因PCR產物HhaI酶切結果

氟烷基因PCR產物HhaI酶切結果見附圖。

附圖 氟烷基因PCR產物HhaI酶切結果

4 討論

M—2000 bp的DNAmarker；1、2、3—NN型；4—Nn型

4.1 豬毛中DNA樣品的制備

以純化的DNA作為模板，在一定范圍內增加模板的量可以提高擴增產物的量。本試驗中隨著豬毛根數的增加，PCR產物也隨著增加。以4～6根時效果最好，7根以后擴增產物的量開始下降。有研究表明，當細胞數增加到600時，PCR產物量并不增加到4 800，PCR產物量則開始下降，這是由于DNA鏈附近大量細胞碎片使PCR反應受到了一定的抑制。其次，設計反應體系的關鍵是既能使DNA得到抽提，而又不破壞Taq酶的活性。在DNA抽提過程中通常用蛋白酶溶解細胞成分和蛋白，蛋白酶的活性受熱易失活，不會影響DNA的抽提，而與DNA結合緊密的粗蛋白，Taq酶卻不受低熱和無毒性試劑的影響，確保了Taq酶的活性。

4.2 PCR－RFLP分析

PCR產物經內切酶HhaI酶切后，基因未發生突變時，內切酶HhaI可將PCR擴增的特異片段酶切成493 bp和166 bp兩條帶，則可判定基因型為NN。當氟烷基因兩個位點都發生突變（C1843→T1843）時，HhaI限制內切酶識別位點消失，659 bp擴增的片段不能被酶切消化，電泳后只有一條帶，基因型為nn。當一個氟烷等位基因發生突變（C1843→T1843），而另一個正常，用HhaI酶切可以觀察到659 bp、493 bp和166 bp 3條帶，其基因型為Nn。

5 結論

豬應激綜合征檢測的傳統方法是用氟烷麻醉法，但該方法不能識別雜合子和陰性豬，且操作誤差較大。而通過提取DNA利用PCR－RLFP進行檢測，可以100%地檢測出純合子和雜合子，這樣就克服了用氟烷檢測費時、費力而且不能測出雜合子的弊端。用血樣和毛囊均能提取DNA，血樣中DNA純度更高，便于擴增但血樣的采集要保定豬只，通常體重在30 kg以內的仔豬采用該法，對成年豬由于體重原因往往僅采用毛囊提取DNA。通過對種豬場的長白、大約克和杜洛克的檢測發現，由于高瘦肉率種豬的大量引進使種豬群中氟烷基因頻率明顯增高，長白、大約克和杜洛克豬群都含有一定比例的氟烷應激基因。

種豬的遺傳改良是豬群生產性能改良的基礎，而種豬性能測定制度是豬遺傳改良的重要技術措施和保證條件，因此，在種豬性能測定中，除使用現有的生長發育性能測定和外貌選擇外，還要從種豬分子遺傳結構方面進行性能測定，特別是對氟烷基因型的檢測。張金玲等通過PCR－RFLP技術對嘉興地區部分豬場新嘉興黑豬血樣進行氟烷基因檢測，結果表明，37頭新嘉興黑豬基因型均為NN，未出現Nn和nn基因型[11]。及早進行檢測具有可以及時淘汰隱性純合子個體、在父母代選配上避開雜合子公豬和雜合子母豬的選配、在后備豬群中控制氟烷基因的存在。

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