ADAM17-siRNA抑制人MCF-7乳腺癌細胞體外侵襲能力的研究*

楊雯靖 張雪鵬 焦桂梅 趙光明 路延芹 胡寶山

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其侵襲與轉移的生物學特征是導致乳腺癌復發、轉移及患者死亡的主要原因[1]。乳腺癌為激素依賴性腫瘤，內源性激素在乳腺癌的發生發展中起著重要的作用。解聚素-金屬蛋白酶（adisintegrin and metallo?protease，ADAM）是近年來發現的一類細胞膜表面糖蛋白家族，具有多種功能，最新研究表明其與腫瘤侵襲和轉移密切相關[2]。ADAM17是ADAM家族成員之一，又名腫瘤壞死因子（TNF）-ɑ轉化酶（TACE），可以通過降解細胞基底膜和細胞外基質及影響組織的重塑促進腫瘤的局部浸潤和轉移。ADAM17在多種腫瘤組織中均呈高表達[3-4]。本研究通過RNA干擾（RNAi）技術封閉人乳腺癌細胞內ADAM17的表達，觀察其對癌細胞體外侵襲能力的影響，為腫瘤治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 細胞及細胞培養 人MCF-7乳腺癌細胞株購自中國醫學科學院血液學研究所，置于37℃、5%CO2孵箱中常規培養。

1.2 主要試劑 Lipofectamine 2000、Trizol、逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）試劑盒購自Promega公司；Transwell小室、Matrigel購自BD公司。質粒siRNA由上海吉瑪公司化學合成，針對ADAM17的小干擾RNA（ADAM17-small interference RNA，ADAM17-siRNA），序列為5′-TGAGGCAGTCTCTCCTATTCCTGACCAGC-3′，干擾的無義序列RNA的序列為5′-TGACCACCCTGACCTACGGC GTGCAGTGC-3′。兔抗人ADAM17多克隆抗體購自美國Ad?cam公司，兔抗人β-actin、DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 siRNA的轉染及實驗分組 細胞生長至80%融合時，無血清改良的依格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medi?um，DMEM）培養液培養1 h。采用脂質體Lipofectamine 2000介導，按產品說明書操作。實驗分為3組，每組設2個復孔，平行實驗3次。（1）乳癌組：加入1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）。（2）轉染對照組：加入等量干擾的無義序列siRNA。（3）ADAM17-siRNA組（轉染組）：加入等量的ADAM17-siR?NA。基因轉染6 h后更換為含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養液繼續培養。

1.4 real-time PCR檢測ADAM17 mRNA的表達 轉染48 h后，每組取2個復孔，平行實驗3次。Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄后行real-time PCR。ADAM17引物序列上游：5′-ATCAAACCCTTTCCTGCG-3′，下游：5′-CAAACCCATCCT CGTCCA-3′，擴增片段長度154 bp。β-actin上游：5′-CTGGA ACGGTGAAGGTGACA-3′，下游：5′-AAGGGACTTCCTGTAA CAATGCA-3′，擴增片段長度為165 bp。PCR的反應條件：95℃預變性5 min，95℃ 20 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環，72℃延伸10 min。電腦分析基因的擴增情況，導出相應的域值循環數，并以β-actin的表達作為內參，計算基因的相對表達量。各組ADAM17的Ct值均經β-actin校正，以正常組的表達作為100%。

1.5 Western blot檢測ADAM17蛋白的表達 轉染48 h后，細胞裂解液[50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40），0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS），0.5% 溶解有機碳（DOC），2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），10 μmol/L亮抑酶肽（leupeptin），1 μmol/L胃酶抑素A（pepstatin A），1 g/L胰蛋白酶抑制劑（apro?tinin）]裂解細胞，冰浴 30 min后,低溫離心10 min，收集上清。考馬斯亮藍染色檢測總蛋白濃度后，取50 μg總蛋白按常規方法進行7.5%SDS-PAGE電泳并轉膜，根據Marker定位保留含目的條帶區域的硝酸纖維素膜并用質量分數為0.05的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入封閉液稀釋的抗ADAM17或β-actin的Ⅰ抗，4℃過夜。次日漂洗3次后，加入稀釋后的Ⅱ抗，室溫放置1 h。漂洗3次，加入DAB顯色。共行3次Western blot實驗。ADAM17蛋白在110 ku處顯示特異性條帶，設分子質量為42 ku的β-actin為內參。圖片分析儀掃描后，Quantity one軟件分析。

1.6 體外侵襲實驗 采用Transwell小室實驗方法，制備趨化因子。當細胞至90%融合時，無血清DMEM培養48 h，收集培養液，低溫離心取上清，-20℃保存備用。制備Transwell小室，Matrigel用預冷的無血清DMEM按照2∶1的比例稀釋后滴加在Transwell上室的聚碳酸酯膜上，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成凝膠。隨后將轉染后的細胞（5×105/mL，100 μL）滴加到上層小室，在下室中加入按1∶1混合的趨化因子和完全培養基500 μL，5%CO237℃條件下培養24 h，經HE染色后顯微鏡下（×100）觀察穿過Transwell小室的細胞數量，作為評價侵襲能力的指標。每組設3個復孔，平行實驗2次。每張切片隨機計數8個視野的細胞數，計算平均值。

1.7 統計學分析 數據分析采用SPSS 17.0軟件，正態分布資料用x ±s表示，應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADAM17 mRNA的表達 ADAM17 mRNA在乳癌組中高表達，轉染對照組能降低這種表達，但轉染組可明顯抑制ADAM17 mRNA的表達，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 ADAM17蛋白的表達 ADAM17在乳癌組中高表達，轉染對照組不能降低這種表達，但轉染組卻可抑制ADAM17的表達，差異有統計學意義（P<0.01），見圖1、表1。

表1 人MCF-7乳腺癌細胞中ADAM17 mRNA的表達（x ±s）

圖1 Western blot檢測ADAM17-siRNA作用下人MCF-7乳腺癌細胞表達ADAM17蛋白的情況

2.3 腫瘤細胞體外侵襲能力的檢測 乳癌組的腫瘤細胞可明顯穿過人工基底膜到達下室。轉染對照組到達下室的細胞數量與乳癌組比較差異無統計學意義（P>0.05）。但轉染組穿過人工基底膜到達下室的乳腺癌細胞數量明顯減少，與乳癌組比較差異有統計學意義（P<0.01），見圖2、表1。

3 討論

圖2 Transwell小室實驗檢測ADAM17-siRNA作用下人MCF-7乳腺癌細胞穿透濾膜的情況（HE×100）

近年，我國乳腺癌發病率呈上升趨勢，已經成為女性死亡的第2位病因[5]。侵襲和轉移是造成乳腺癌患者最終死亡的主要原因。目前雖通過早發現、早診斷及早治療等原則使乳腺癌患者的生存率有所提高，但結果仍不盡人意。因此，探討乳腺癌侵襲和轉移等預后指標的生物學標志物是目前乳腺癌研究的主要方向。在腫瘤的浸潤、轉移過程中，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的降解是最重要的條件，而ECM的降解主要依靠各種蛋白水解酶，其中基質金屬蛋白酶（MMPs）是基質降解代謝的主要酶類。MMPs幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用，被認為是該過程中主要的蛋白水解酶[6]。ADAM17屬于MMPs，可以降解細胞基底膜和細胞外基質，因而在腫瘤的侵襲轉移中發揮重要作用。

有研究顯示ADAM17在正常乳腺組織中少量或不表達，在乳腺纖維瘤組織中表達有所增強，而在人乳腺癌組織中表達明顯增高[7]。因此通過不同的手段抑制ADAM17的表達可以降低腫瘤細胞的惡性表達，其中RNAi是一項有效的基因沉默新技術。與傳統的基因治療相比，因其具有高度的特異性和很高的效率，可使腫瘤治療的針對性更強、不良反應更小。尤其是siRNA干涉載體的出現，可有效干涉目的基因的表達[8]，可與其靶mRNA的3′非翻譯區特異性結合，引起靶mRNA的翻譯抑制或降解，在細胞的生長、分化等過程中發揮癌基因或抑癌基因的作用，從而為乳腺癌致病基因研究提供了新的途徑[9]，這些干涉載體的出現可以大大降低使用成本、提高轉染效率，從而極大地促進了RNAi的應用。

本實驗采用化學合成的siRNA干擾片段轉染乳腺癌細胞，進而觀察腫瘤細胞的體外侵襲能力。Re?al-time PCR檢測顯示轉染組細胞的ADAM17表達量顯著降低，說明針對ADAM17的siRNA可以有效地抑制ADAM17mRNA的表達，而且Western blot檢測ADAM17蛋白的表達也明顯下降，說明特異性的ADAM17-siRNA可以通過抑制ADAM17mRNA的表達來抑制其蛋白的表達，從而抑制ADAM17蛋白的生物學功能。本研究體外侵襲實驗顯示轉染組細胞的穿膜數與乳癌組和轉染對照組相比顯著降低，表明ADAM17的表達受抑制后可降低腫瘤細胞降解細胞外基質的能力，從而抑制腫瘤細胞的侵襲能力。本實驗結果表明ADAM17在人乳腺癌細胞的侵襲中具有重要的促進作用，以此為靶點可作為乳腺癌基因治療的一個新方向。

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