干擾素基因多態(tài)性與干擾素治療慢性乙肝早期應(yīng)答的關(guān)系

潘永平 樊曉慧 邱夢標(biāo) 粟慶娟 毛紅霞 熊水印 龔 輝

干擾素（IFN）是慢性乙型肝炎（CHB）的主要治療藥物之一。但應(yīng)用IFN治療的人群應(yīng)答效果往往差異很大，其原因除了乙肝病毒（HBV）本身生物學(xué)特征及宿主對HBV的免疫狀態(tài)等因素外，宿主IFN遺傳通道上眾多基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）也是影響IFN應(yīng)答的重要因素。IFN-γ基因874位點的類型與IFN的表達及疾病的易感性有關(guān)[1]。但其與IFN的療效是否有關(guān)，國內(nèi)文獻報道較少。本研究應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法分析IFN-γ內(nèi)含子基因874位點的基因多態(tài)性，研究SNP與IFN早期應(yīng)答的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2005年8月—2010年2月在我院使用IFN α-2b治療的CHB患者106例，其中男79例，女27例，平均年齡（35.0±10.2）歲，均為漢族。均符合2005年慢性乙肝防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。HBsAg、HBeAg和HBcAb均陽性，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）高于正常上限2倍以上，既往未用過IFN或核苷（酸）類似物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：非漢族，急性乙型肝炎，重型乙型肝炎,失代償期肝硬化，合并其他肝炎病毒感染，自身免疫性疾病及有嚴重心、肺、腎疾患，糖尿病，甲狀腺功能亢進或低下，神經(jīng)精神疾病等[3]。另選擇健康漢族成年人89例作為對照組。

1.2 治療方案 CHB患者給予IFN α-2b 3~5 mU/d，皮下注射，連續(xù)15 d誘導(dǎo)治療后，隔日注射1次，療程12個月。在治療0、3、6、9、12 個月及停藥6個月隨訪并檢測肝功能、HBsAg、HBeAg、HbcAb及HBV DNA。

1.3 早期應(yīng)答評價 早期完全應(yīng)答：治療24周后患者HBV DNA<1×103copies/L；早期部分應(yīng)答：治療24周后患者HBV DNA 1×103~1×104copies/L；早期無應(yīng)答：治療24周后患者HBV DNA>1×104copies/L。

1.4 目的基因多態(tài)性檢測

1.4.1 提取基因組DNA 取患者抗凝血標(biāo)本300 μL，加入裂解緩沖液 500 μL（含 10 mmol/L pH 8.0 的 Tris2HCl、0.1 mol/LEDTA、20 mg/L胰RNA酶、0.5%SDS），37℃溫浴1 h后加蛋白酶K（20 g/L）10 μL過夜，采用常規(guī)的酚氯仿法提取患者基因組DNA。

1.4.2 PCR-RFLP 應(yīng)用美國PE公司生產(chǎn)的PCR儀及有關(guān)試劑進行基因擴增，PCR反應(yīng)體積50 μL，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60℃50 s，72℃40 s，共30個循環(huán)。酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物10 μL，10 ×緩沖液 2 μL，HhaⅠ內(nèi)切酶 0.3 μL（1×107U/L），10 ×牛血清白蛋白（BSA）2 μL，6×染料3 μL，補去離子水至總體積20 μL。上述反應(yīng)體系在37℃酶切4 h后于2%瓊脂糖凝膠電泳60 min，在紫外燈下鑒定酶切物。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SAS數(shù)理統(tǒng)計軟件包進行分析。先計算各組各位點基因型分布頻率及等位基因頻率，確認其符合Hardy-Weinberg平衡。頻率比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，

2 結(jié)果

2.1 PCR電泳結(jié)果 TT基因型為400 bp一條帶，TA基因型為400 bp和262 bp兩條帶，AA基因型為262 bp一條帶，見圖1。

2.2 2組IFN-γ基因874位點的基因型和等位基因分布 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗，達到遺傳平衡，具有群體代表性。CHB組的AA基因型和A等位基因頻率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

表1 2組IFN-r基因874位點基因多態(tài)性分布 例（%）

2.3 IFN-γ基因874位點多態(tài)性與干擾素療效的關(guān)系 早期無應(yīng)答組的AA基因型頻率高于早期完全應(yīng)答組和早期部分應(yīng)答組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 IFN-γ基因874位點多態(tài)性與干擾素早期應(yīng)答例（%）

3 討論

國內(nèi)研究慢性HBV基因型與IFN抗病毒療效關(guān)系的文章較多。如鐘淵斌等[4]回顧性調(diào)查145例IFNα治療組和對照組的臨床資料,并用PCR-RFLP分析其HBV基因型及對IFN的應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B基因型HBV對IFNα的有效應(yīng)答率高于C型。另外，國內(nèi)也見到IFN-γ基因多態(tài)性與HBV感染關(guān)系的研究，如張平安等[1]采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）技術(shù)檢測231例慢性HBV攜帶患者、165例自限性HBV感染者和135例正常對照者IFN-γ基因內(nèi)含子874位點T/A單核苷酸多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)IFN-γ基因內(nèi)含子874位點多態(tài)性與慢性HBV感染有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，慢性乙肝患者對IFN治療的早期應(yīng)答與IFN基因型有關(guān)，早期無應(yīng)答患者中AA基因型占絕對優(yōu)勢。AA基因型患者IFN治療總體應(yīng)答率不如其他兩種基因型患者。提示IFN基因型可能是通過高表達或提高IFN對宿主靶細胞的作用效率而取得更高療效的。

[1]張平安，吳健民，李艷.干擾素γ基因內(nèi)含子1+874位點多態(tài)性與乙型肝炎病毒感染關(guān)系的研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2006,27(1)：41-43.

[2]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙肝防治指南[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2006，25（5）：1-5.

[3]楊紹基，任紅.傳染病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008:45-46.

[4]鐘淵斌，楊茜，張倫理.慢性乙型肝炎病毒基因型與干擾素療效關(guān)系的研究[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗,2007,25(6)：553-554.