黑曲霉發酵豆粕對豆粕中酸溶蛋白含量影響的研究

朱平軍，程茂基，江 濤，邱良偉，關嬌嬌

（安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036）

發酵豆粕是一種新型植物蛋白飼料原料，其以豆粕為主要原料，運用微生物發酵技術生產而成，與豆粕相比，發酵豆粕的抗營養因子水平大為降低，營養水平和使用價值得到提高，應用范圍也更加廣泛[1]。在發酵豆粕生產中，常使用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、黑曲霉和米曲霉菌等一種或數種微生物菌種進行發酵，其中黑曲霉因為其獨特的性質而受到特別青睞。黑曲霉具有產酶能力強、酶系豐富等特點，可以分泌植酸酶、蛋白酶、纖維素酶等多種消化酶，是經美國FDA批準允許應用在飼料中的益生菌之一[2-3]。

發酵豆粕質量檢測的指標包括感官指標、常規指標（灰分、氨基酸）、抗營養因子去除程度和小分子蛋白的含量等。本試驗使用黑曲霉發酵豆粕，利用黑曲霉產生的蛋白酶等消化酶降解豆粕中的蛋白質，使豆粕大分子蛋白降解為小分子蛋白、肽類和氨基酸等。為簡單起見，本試驗以黑曲霉發酵豆粕中酸溶蛋白含量作為試驗測定指標。

1 試驗材料

1.1 微生物菌株

黑曲霉益生菌株AN03為本實驗室選育保存（N+注入誘變選育的高產酸性蛋白酶菌株）。

1.2 培養基

斜面培養基和種子培養基均為土豆培養基，種子培養基不加瓊脂。

1.3 試驗原料

豆粕購自合肥市場。

1.4 黑曲霉發酵種子液的制備

從新鮮黑曲霉斜面中挑取一環菌，接入裝有50mL液體土豆培養基和數粒玻璃珠的三角瓶中，120 rpm振蕩培養24 h。

2 試驗方法

2.1 酸溶蛋白含量的測定方法

參照大豆肽粉標準（QB/T 2653-2004）中酸溶蛋白質含量的測定，準確稱取樣品2.00 g，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液10mL，混合均勻，靜置5min。將溶液定量轉移，在4 000 rpm下離心10min后，取全部上清液，按GB/T 14771-1993規定的方法測定上清液可溶蛋白質。蛋白質換算系數為6.25，測定結果根據樣品的干燥失重，折算為干基。

2.2 單因素檢測對黑曲霉發酵豆粕的影響試驗

2.2.1 發酵時間

取30 g豆粕于自封袋中（開口發酵，下同），發酵溫度28℃，接種量6%，料水比1∶1，置于振蕩培養箱中，研究發酵時間0、24、48、72、96和120 h對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。試驗分為6組，每組2個重復，每個重復2袋，下同。

2.2.2 發酵溫度

取30 g豆粕于自封袋中，發酵時間72 h，接種量6%，料水比1:1，置于振蕩培養箱中，研究發酵溫度26、27、28、29、30和31℃對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。

2.2.3 接種量

取30 g豆粕于自封袋中，發酵時間72 h，發酵溫度28℃，料水比1∶1，置于振蕩培養箱中，研究接種量2%、4%、6%、8%、10%和12%對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。

2.2.4 料水比

取30 g豆粕于自封袋中，發酵時間72 h，發酵溫度28℃，接種量6%，置于振蕩培養箱中，研究料水比1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1和1∶1.1對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。

2.3 正交優化試驗

根據單因素試驗結果，選取單因素中對試驗指標影響較大的試驗條件進行正交試驗，進一步優化黑曲霉發酵豆粕的發酵條件。正交試驗每組設2個重復。

2.4 統計分析

試驗數據采用正交設計助手和SAS 9.1進行數據處理分析，結果以平均值±標準誤標示。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗對黑曲霉發酵豆粕的影響

3.1.1 發酵時間

發酵時間對黑曲霉發酵豆粕的影響見表1。

表1 發酵時間對黑曲霉發酵豆粕的影響%

由表1可見，未發酵豆粕原料中酸溶蛋白含量僅有1.75%，黑曲霉發酵24 h后發酵產品中酸溶蛋白含量就達到9.63%，發酵96 h含量最高可達11.59%，隨發酵時間的延長酸溶蛋白含量又開始下降，原因是達到酸溶蛋白含量最高以后，發酵時間再延長，黑曲霉就會把先前降解成的肽類和氨基酸等繼續降解為氨等揮發掉，致使發酵產品中酸溶蛋白含量下降。

3.1.2 發酵溫度

發酵溫度對黑曲霉發酵豆粕的影響見表2。

由表2可見，隨著發酵溫度的升高，產品中酸溶蛋白的含量先是逐漸上升，而后又逐漸降低，這是因為初始溫度低于黑曲霉產酶的最適溫度，從低溫到最適產酶溫度黑曲霉產酶量會逐漸增加，所以酸溶蛋白含量也隨溫度升高而上升。隨后溫度提高致黑曲霉生長速度加快，產生大量孢子，反而不利于產酶，所以達最適產酶溫度后，再提高溫度高反而致酸溶蛋白含量降低。

3.1.3 接種量

接種量對黑曲霉發酵豆粕的影響見表3。

表2 發酵溫度對黑曲霉發酵豆粕的影響%

表3 接種量對黑曲霉發酵豆粕的影響%

由表3可見，發酵后酸溶蛋白質含量隨接種量的提高而逐漸上升，達一定程度后又開始下降，原因可能是接種量達一定比例后，發酵底物豆粕中微生物會達到飽和，相互競爭底物，競爭的結果反而不利于部分發酵微生物的生存。

3.1.4 料水比

料水比對黑曲霉發酵豆粕的影響見表4。

由表4可見，料水比約為1∶0.9，發酵產品中酸溶蛋白含量最高，這是因為發酵微生物生長需要一定含量的水分，料水比低，發酵料中水分就供應不足，使微生物生長受到抑制，不利于產酶，從而導致發酵產品中酸溶蛋白含量低。相反，料水比高，發酵料過濕，就會影響發酵原料的透氣性，同樣使黑曲霉生長受到抑制。

表4 料水比對黑曲霉發酵豆粕的影響%

3.2 正交試驗結果及分析

根據單因素試驗結果，以發酵時間、溫度、接種量和料水比，做L9（34）正交優化試驗。正交試驗結果見表5～6。

表5 正交試驗L9（34）因素水平

由表6直觀分析表明，影響黑曲霉發酵豆粕中酸溶蛋白含量的4個因素的主次順序依次是：時間＞溫度＞料水比＞接種量，理論上酸溶蛋白含量最高的組合是A2B2C1D2，即發酵時間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。

表6 正交試驗L9（34）直觀分析

由表6正交試驗方差分析表明，發酵時間、發酵溫度分別對黑曲霉發酵豆粕中酸溶蛋白含量有極顯著影響和顯著影響。

因正交試驗中未包含最佳發酵組合A2B2C1D2，根據理論最佳發酵組合條件進行驗證試驗，發酵后測得發酵豆粕中酸溶蛋白含量平均為13.62%，含量高于正交試驗中所有試驗組合。所以A2B2C1D2是本試驗的最佳發酵組合條件，即發酵時間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。

4 討 論

應用發酵技術處理豆粕，是有效提高豆粕品質的方法之一，在發酵過程中能產生可以直接被動物吸收的小肽和其他多種生物活性物質，這對動物的生長十分有利[4]。小分子蛋白含量是衡量發酵豆粕質量的主要指標之一，我國企業常使用三氯乙酸酸溶蛋白作為發酵豆粕中小分子蛋白含量的常規檢測方法。

黑曲霉發酵豆粕能提高豆粕中酸溶蛋白的含量，主要是由于黑曲霉在發酵過程中產生的酸性蛋白酶、纖維素酶等消化酶對豆粕原料進行消化的結果，所以在試驗中影響消化酶產量和消化酶活力的因素均可能對發酵產品中酸溶蛋白含量產生影響。本試驗所用黑曲霉菌株是經過N+注入誘變選育的高產酸性蛋白酶菌株，不僅具有很強的產酸性蛋白酶的能力，而且還具有很強的產纖維素酶和果膠酶的能力[5]。另外，黑曲霉產生的酸性蛋白酶主要是端肽酶（如天冬氨酸蛋白酶），端肽酶能從大豆蛋白肽鏈的末端開始水解，特異性地切斷疏水性多肽末端的兩種疏水性氨基酸，使大分子蛋白被切成數段的小分子，即大豆肽。Yoshitsugu等研究發現，酸性蛋白酶酶解的產物主要是相對分子質量為300～600的小肽，酸性羧肽酶的酶解產物主要是相對分子質量為200～400的小肽[6]。由于黑曲霉還能分泌的纖維素酶、果膠酶等消化酶，這些消化酶能破壞植物原料細胞壁，促使細胞中的營養物質釋放出來，利于酸性蛋白酶與大分子蛋白充分接觸，大分子蛋白被降解為小分子蛋白。衛琳等用黑曲霉AS3.350固態發酵豆粕生產大豆肽，研究得到最佳工藝條件為發酵料坯中豆粕含量為87%、pH 5.8、發酵溫度為30℃，發酵時間為90 h，在該條件下發酵豆粕中大豆肽的轉化率為62.35%[7]。秦衛東等在用黑曲霉發酵豆粕制備抗氧化肽的試驗中發現，在接種量為2%、發酵液pH 6.0、底物質量濃度9 g·100mL-1、發酵時間34 h的條件下，所得發酵液中豆粕多肽的質量濃度最高，為3.38mg·mL-1[8]。由以上試驗可以看出，上述黑曲霉發酵豆粕試驗結果與本試驗結果具有一致性，即黑曲霉發酵豆粕能提高產品中小分子蛋白的含量。嚴鶴松通過對影響黑曲霉發酵豆粕進行正交實驗，結果表明，最佳的發酵工藝條件為接種量0.5%、料水比1∶1、發酵時間3 d、溫度35℃、裝料量20 g（直徑7 cm×高8 cm罐頭瓶中）[9]。

5 結論

本試驗表明，發酵時間和發酵溫度是影響黑曲霉發酵豆粕中酸溶蛋白含量的主要因素，經過正交試驗優化與分析得到最佳發酵工藝條件，即發酵時間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。黑曲霉發酵豆粕能明顯提高豆粕中的酸溶蛋白含量，提高豆粕的營養水平，酸溶蛋白含量由發酵前的1.75%提高到13.62%。

[1]李建.發酵豆粕研究進展[J].糧食與飼料工業,2009（6）:31-35.

[2]蔡輝益,霍啟光.飼用微生物飼料添加劑研究與應用進展（續）[J].飼料工業,1993,14（5）:7-11.

[3]王春芳,王彩玲,程茂基.黑曲霉固態生料發酵對棉粕中游離棉酚的影響[J].飼料博覽,2011（1）:25-26.

[4]王立波,李斌.發酵豆粕工藝與固體發酵過程監測指標初探[J].飼料博覽,2010（9）:25-27.

[5]程茂基,陳麗娟,蔡克周,等.N+注入選育黑曲霉益生菌及其突變菌株產酶條件的研究[J].微生物學報,2005,45（4）:534-538.

[6]Yoshitsugu I,Tasuku Y,Toshinari T,etal.Properties of the peptides liberated from rice protein in Sokujo-moto[J].Journal of Bioscienceand Bioengineering,1999,88（3）:276-280.

[7]衛琳,宋俊梅,寧維穎.黑曲霉固態發酵制備大豆肽發酵條件的研究[J].飼料工業,2008,29（18）:51-52.

[8]秦衛東,陳學紅,馬利華.黑曲霉發酵豆粕制備抗氧化肽研究[J].食品科學,2010,31（23）:289-293.

[9]嚴鶴松.黑曲霉發酵豆粕的研究[D].武漢:華中農業大學,2009.