雙波長(zhǎng)RP-HPLC法測(cè)定清開靈膠囊中梔子苷和黃芩苷的含量

師永花

清開靈組方源于中醫(yī)治療急性熱病傳統(tǒng)處方“溫病三寶”中的安宮牛黃丸，由膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷、珍珠母、梔子、水牛角、板藍(lán)根、金銀花組成，迄今為止已形成系列產(chǎn)品［1］。中藥制劑分析中，多使用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)。清開靈膠囊中君藥黃芩的黃酮類有效成分為黃芩苷，臣藥梔子的環(huán)烯醚萜苷類的有效成分為梔子苷。為了更好地控制藥品質(zhì)量，本文采用雙波長(zhǎng)RP-HPLC法，同時(shí)測(cè)定該制劑中的梔子苷和黃芩苷含量。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(真空脫氣機(jī)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，二級(jí)管陣列檢測(cè)器)，色譜柱:Hibor C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);AS3120型超聲波清洗器;Mettler Toledo AB204-S電子分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 無水甲醇:分析純、色譜純，乙腈:色譜純，水為重蒸餾水;梔子苷對(duì)照品:中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):0749-9401供含量測(cè)定用;黃芩苷對(duì)照品:中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):715-8501，供含量測(cè)定用;清開靈膠囊:廣州白云山明興制藥有限公司，批號(hào):MM3112、MM3111、MM3113，規(guī)格:0.25 g×12粒。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品1.8 mg、梔子苷對(duì)照品1.6 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，即得含黃芩苷、梔子苷分別為0.18 mg/mL、0.16 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精確量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按體積1∶1混合，即得標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，其中梔子苷:0.08 mg/mL;黃芩苷:0.09 mg/mL。

2.1.2 樣品溶液的制備 取樣品適量，置研缽中研細(xì)，取粉末約0.25 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，精確加入無水甲醇定容，超聲提取30 min，放冷，擦凈容量瓶外表水分，補(bǔ)足減失甲醇重量，搖勻，靜置。用被甲醇潤(rùn)洗的注射器吸取適量上清液，再用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 分別制備不含黃芩、梔子陰性對(duì)照樣品，并按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱:Hibor C18鍵合硅膠柱(4.6 mm ×160 mm，5 μm)。流動(dòng)相:A 相為0.2%磷酸水溶液，B相為乙腈。梯度洗脫程序:0～10 min時(shí)，流動(dòng)相為B相-A相(12∶88)，流速:0.8 mL/min;10 min之后，流動(dòng)相為B相-A相(25∶75)，流速:1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)分別為240 nm(梔子苷)、278 nm(黃芩苷)。柱溫:30℃。流動(dòng)相梯度洗脫配比和流速數(shù)據(jù)見表1。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液、各陰性樣品溶液、樣品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，在樣品溶液色譜圖中，有與對(duì)照品混合溶液梔子苷、黃芩苷保留時(shí)間一致的特征峰，保留時(shí)間分別為7.50 min、16.00 min，陰性樣品無此特征峰，表明陰性樣品對(duì)所測(cè)組分無干擾。色譜圖見圖1、圖2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫配比和流速數(shù)據(jù)(%)

圖1 240 nm處色譜圖注:A對(duì)照品，B樣品，C缺桅子陰性樣品;1桅子苷，2黃芩苷

圖2 278 nm處色譜圖注:A對(duì)照品，B樣品，C缺黃芩陰性樣品;1桅子苷，2黃芩苷

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、30.0 μL，按“2.3”所述色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，梔子苷回歸方程:Y=1 417.7X+81.31，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7(n=7);黃芩苷回歸方程:Y=2 580.2X+40.314，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明，梔子苷在0.16～2.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃芩苷在0.18～2.7 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別取同一濃度對(duì)照品溶液，按“2.3”所述色譜條件，自動(dòng)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量6 μL，記錄色譜圖，結(jié)果如表3。梔子苷峰面積RSD為0.31%，黃芩苷峰面積RSD為0.19%。表明儀器和方法精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批號(hào)(MM3112)樣品6份，按“2.1.2”樣品溶液的制備方法制備溶液。精密吸取制備好的樣品溶液6 μL，在“2.3”所述色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄梔子苷和黃芩苷的峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果，梔子苷的 RSD值為0.78%，黃芩苷的 RSD值為0.04%，表明樣品和實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取配置好的同一批號(hào)(MM3112)清開靈膠囊樣品溶液，室溫下放置，分別于制備后 0、2、4、6、8h各進(jìn)一次樣，進(jìn)樣量為6 μL。記錄梔子苷和黃芩苷的峰面積，計(jì)算梔子苷的RSD值為0.79%，黃芩苷的RSD值為0.04%。結(jié)果表明，樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 含量測(cè)定 分別取3批不同批號(hào)(MM3112、MM3111、MM3113)的清開靈膠囊，樣品量分別為0.250 5 g、0.250 9 g、0.250 1 g，去殼研細(xì)，按“2.1.2”樣品溶液的制備方法制備。樣品溶液進(jìn)樣量為6 μL，在“2.3”所述色譜條件下分別進(jìn)樣2次，記錄梔子苷和黃芩苷的峰面積，計(jì)算每1 g樣品中所含梔子苷和黃芩苷的量(mg/g)，結(jié)果如表 2所示。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

若將含量單位換算為mg/mL，則含梔子苷2.307 0mg/g的樣品，含梔子苷的量為0.023 12 mg/mL;含黃芩苷39.154 2 mg/g的樣品，含黃芩苷的量為0.392 5 mg/mL。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量同一批號(hào)(MM3112)的樣品約0.12 g，精密稱定，置25mL量瓶中，按“2.1.2”樣品溶液制備方法制備樣品溶液，取上述溶液2 mL(含梔子苷0.023 08 mg、黃芩苷約0.391 8 mg)，置10 mL量瓶中，加梔子苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL、黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，加無水甲醇定容。用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.3”所述色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量20 μL，記錄峰面積，計(jì)算回收率。梔子苷的平均加樣回收率為96.94%，RSD為2.08%;黃芩苷的平均加樣回收率為100.18%，RSD為2.01%，證明上述方法可靠。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)過程中選用過很多色譜條件進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，包括乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液等，但是分離效果都不好，目標(biāo)成分和其他雜質(zhì)成分分不開。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中乙腈的比例越高，洗脫能力越強(qiáng)，對(duì)化合物的選擇性越高，分離出化合物越精細(xì)。但流動(dòng)相中乙腈的比例過高，會(huì)導(dǎo)致樣品液中各化合物過早出峰，不能完全分開，因此，只能運(yùn)用梯度洗脫，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)提高流動(dòng)相中乙腈的比例，增大流動(dòng)相流速，使各化合物先后出峰，找到最佳的有效成分分離條件。實(shí)驗(yàn)中選擇乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相，梔子苷保留時(shí)間在7.5 min，黃芩苷保留時(shí)間在16.0 min。

圖3 梔子苷色譜圖

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇會(huì)影響到色譜分析的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器。據(jù)二極管陣列檢測(cè)器吸收光譜圖可以看出，梔子苷在240 nm處有最大吸收(見圖3)，黃芩苷在275 nm處有最大吸收(見圖4)［2］，所以實(shí)驗(yàn)中采用240 nm、278 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖4 黃芩苷色譜圖

3.3 溶劑的選擇 梔子苷易溶于水，溶于甲醇;黃芩苷微溶于水，溶于甲醇。實(shí)驗(yàn)中分別用30%、50%、70%和100%的甲醇溶液作為溶劑，進(jìn)行超聲提取，分別進(jìn)樣并記錄色譜圖，發(fā)現(xiàn)用70%的甲醇水溶液作為溶劑提取效果較好;黃芩苷在甲醇、水中的溶解度較小［2］，所以在配制黃芩苷標(biāo)樣時(shí)濃度不宜太大。

3.4 提取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)時(shí)將研細(xì)后的藥品用70%的甲醇(分析純)轉(zhuǎn)移，置于25 mL的容量瓶中，分別用超聲儀提取20 min、30 min、40 min、60 min。通過比較發(fā)現(xiàn)，提取30 min的效果比提取20 min的效果好，和提取40 min效果一樣。而提取60 min的樣品分離出了太多雜質(zhì)，影響樣品的測(cè)定，所以，所有樣品均超聲提取30 min。

［1］ 張妙媛，姚金成，趙緒元，等.清開靈不同制劑的高效液相指紋特征比較［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(2):442-443.

［2］ 國家藥典委員會(huì)，中華人民共和國藥典，2005年版(一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:586，248.