車前子多糖致突變毒性的實(shí)驗(yàn)研究

郭會彩，孫 瑤，王素敏，牛玉杰，張 榮，王永利*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

車前子多糖致突變毒性的實(shí)驗(yàn)研究

郭會彩1，孫 瑤1，王素敏2，牛玉杰1，張 榮1，王永利2*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

目的探討車前子多糖對小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的致突變作用。方法將體質(zhì)量20～26g健康小鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分別為陰性對照組（蒸餾水，diStilled Water）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺，cyclophoSphamide）和車前子多糖3個(gè)劑量組（劑量分別為100、200、400mg/kg）。陰性對照組及車前子多糖3個(gè)劑量組均灌胃給藥，陽性對照組腹腔注射。采用間隔24h，連續(xù)7次給藥，于末次給藥后6h將小鼠處死，用于微核、染色體畸變檢測。另取雄性小鼠50只（15～1Sg），分組及給藥同上，在第1次給藥后第35天觀察精子畸形率。結(jié)果車前子多糖誘發(fā)的微核、染色體畸變和精子畸形率與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。結(jié)論車前子多糖對小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均無致突變作用。

車前子多糖；突變；小鼠

車前子為車前屬植物（plantago aSitica L）的干燥成熟種子，從本草學(xué)考證，具有清熱利尿、腎濕通淋、明目祛痰的功效，近代研究表明具有廣泛的生物學(xué)活性，諸如致泄、護(hù)肝、改變膽汁酸吸收和肝膽固醇代謝、抗炎抑菌、切口愈合、止痛、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、提高機(jī)體免疫力、降壓、降低血清膽固醇的作用［1，2］。車前子多糖則是從車前子中提取的多糖成分，近年來對其的藥效學(xué)研究逐漸增多，如整腸通便、抗衰老、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能等作用［3，4］，說明車前子多糖具有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景。但是關(guān)于車前子多糖的致突變研究作者尚未見報(bào)道。本研究通過觀察車前子多糖對小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的致突變作用，探討車前子多糖對小鼠的遺傳毒性，為車前子多糖的安全使用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康昆明白種小鼠150只，體質(zhì)量20～26g（精子畸形實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量為15～1Sg），醫(yī)動字第703046號，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 主要器材：CHD顯微鏡，日本OlympuS公司；D-7S532高速冷凍離心機(jī)，德國Hettich zentrifugen公司；DK-SA水浴箱，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠。

1.1.3 主要試劑：車前子購自東北吉林藥材公司。秋水仙素，Sigma公司；環(huán)磷酰胺，沈陽藥大藥業(yè)有限責(zé)任公司；GiemSa，上海試劑三廠；甲醇（分析純），天津市化學(xué)試劑一廠；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 車前子多糖提取方法［5］：①車前子與水1∶15微波中高火加熱1min。②過濾。濾液抽濾。③濾液至于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾至原濾液的1/30。④用2倍無水乙醇沉淀過夜。⑤過濾沉淀。沉淀用少量水溶解，將氯仿按多糖水溶液1/5體積加入，然后加氯仿體積1/5的丁醇，劇烈振搖20min，離心，分去水層與溶液層交界處的變性蛋白。重復(fù)5次。⑥過濾沉淀，分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次。⑦干燥。

1.2.2 動物分組及處理：取100只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組20只，分別為陽性對照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg），陰性對照組（蒸餾水），車前子多糖高（400mg/kg）、中（200mg/kg）、低（100mg/ kg）3個(gè)劑量組。陽性對照組腹腔注射給藥，給藥組及陰性對照組經(jīng)口灌胃給藥。0.2mL/10g體質(zhì)量，采用間隔24h，連續(xù)7次給藥，于末次給藥后6h將小鼠處死，用于微核、染色體畸變檢測。另取50只雄性小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，給藥劑量方法同前，末次給藥后繼續(xù)喂養(yǎng)30d，處死后用于精子畸形檢測。

1.2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)［6］：末次給藥后6h，脫臼處死小鼠，取胸骨骨髓制片，甲醇固定15min，10%吉姆薩染色10min，每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核發(fā)生率。同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，求出多染紅細(xì)胞/正染紅細(xì)胞的比值（polychromaticerythrocyte/normochromatic erythrocyte，PCE/NCE）。

1.2.4 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)：末次染毒后6h取材，處死前4h，腹腔注射秋水仙素，取股骨，用磷酸鹽緩沖液沖出骨髓細(xì)胞，經(jīng)低滲，固定制片，10%吉姆薩染色15min，每只小鼠觀察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞，計(jì)算染色體畸變率。

1.2.5 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)：頸椎脫臼法處死，取雙側(cè)附睪，制片，每只小鼠觀察500個(gè)精子，計(jì)算精子畸形率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間兩兩比較采用SNK q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 車前子多糖對小鼠體細(xì)胞的致突變作用

2.1.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核率變化：陽性對照組小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。車前子多糖各劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率與陰性對照組比較無明顯升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各給藥劑量組多染紅細(xì)胞/正染紅細(xì)胞的比值與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明車前子多糖對骨髓細(xì)胞無明顯抑制作用。見表1。此結(jié)果提示車前子多糖無誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核率增加的作用。

表1 車前子多糖對小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響Table 1 The effects of plantain seed polysaccharid on micronucleus of bone marrow cell （n=10，±s）

表1 車前子多糖對小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響Table 1 The effects of plantain seed polysaccharid on micronucleus of bone marrow cell （n=10，±s）

*P＜0.05 vS diStilled water group by q teStPSP：plantain Seed polySaccharid；PCE/NCE：polychromatic erythrocyte/ normochromatic erythrocyte

GroupS MicronucleuS of bone marrow cell CellSMicronucleuS rate（‰）PCE/NCE DiStilled water1 0002.5±0.S51.32±0.25 PSP 100mg/kg1 0002.7±0.S21.25±0.30 PSP 200mg/kg1 0002.9±0.741.26±0.32 PSP 400mg/kg1 0003.S±0.791.36±0.2S CyclophoSphamide1 00030.S±2.53*1.29±0.33

2.1.2 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率變化：小鼠經(jīng)車前子多糖作用后，車前子多糖低、中、高3劑量組均可觀察到畸變的染色體。比如，斷片，斷裂等。采用方差分析及SNK兩兩比較，車前子多糖3個(gè)劑量組與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而相同條件下的陽性對照組骨髓細(xì)胞染色體畸變率顯著高于陰性對照組（P＜0.05），見表2。提示車前子多糖無誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率增加的作用。

表2 車前子多糖對小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率的影響Table 1 The effects of plantain seed polysaccharid on chromosomal aberration of bone marrow cell （n=10，±s）

表2 車前子多糖對小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率的影響Table 1 The effects of plantain seed polysaccharid on chromosomal aberration of bone marrow cell （n=10，±s）

*P＜0.05 vS diStilled water group by q teStPSP：plantain Seed polySaccharid

GroupSCellSMalformation rate（%）DiStilled water1003.4±1.07 PSP 100mg/kg1003.5±1.0S PSP 200mg/kg1004.3±1.34 PSP 400mg/kg1004.S±1.03 CyclophoSphamide10027.1±2.3S*

2.2 車前子多糖對小鼠生殖細(xì)胞的致突變作用：小鼠經(jīng)車前子多糖作用后，車前子多糖低、中、高3個(gè)劑量組均可看見畸變的精子，比如，頭呈扇形，無鉤等。采用方差分析以及SNK兩兩比較之后，3個(gè)劑量組與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），而相同條件下的陽性對照組精子畸形率顯著高于陰性對照組（P＜0.05），見表3。提示車前子多糖無誘導(dǎo)小鼠精子畸形率增加的作用。

表3 車前子多糖對小鼠精子畸形率的影響Table 3 The effects of plantain seed polysaccharid on sperm shape abnormality test in mice （n=10，±s）

表3 車前子多糖對小鼠精子畸形率的影響Table 3 The effects of plantain seed polysaccharid on sperm shape abnormality test in mice （n=10，±s）

*P＜0.05 vS diStilled water group by q teStPSP：plantain Seed polySaccharid

GroupSSperm countMalformation rate（%）DiStilled water50012.4±1.43 PSP 100mg/kg50012.9±1.60 PSP 200mg/kg50013.7±1.70 PSP 400mg/kg50014.0±1.97 CyclophoSphamide50034.7±4.06*

3 討 論

我們前期工作［3，4］研究了車前子多糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖作用的影響及其可能機(jī)制，取得了一定的結(jié)果，表明本產(chǎn)品具有明顯的抗氧化清除自由基作用，能阻滯氧化修飾低密度脂蛋白的產(chǎn)生，并通過釋放一氧化氮使血管松弛和保護(hù)動脈內(nèi)皮作用。并對車前子多糖的一般藥理學(xué)研究及急性毒性進(jìn)行了評價(jià)［7］。

特殊毒性實(shí)驗(yàn)回答的是潛在性危險(xiǎn)問題，其中致突變性實(shí)驗(yàn)是特殊毒性實(shí)驗(yàn)的重要內(nèi)容之一，對于常用的中藥和待開發(fā)的中藥能否引起突變，是否具有遠(yuǎn)期致癌效應(yīng)，不僅是毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容，也是當(dāng)前人們所共同關(guān)心的問題。為了保證安全使用車前子多糖，對其進(jìn)行安全性評價(jià)是很有必要的。本實(shí)驗(yàn)通過觀察車前子多糖對小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的致突變作用，探討了車前子多糖對小鼠的遺傳毒性，表明車前子多糖均無誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核率，骨髓細(xì)胞染色體畸變率，以及生殖細(xì)胞精子畸形率增加的作用。提示車前子多糖對小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均無致突變作用。但就確定藥物的遺傳毒性而言，除體內(nèi)實(shí)驗(yàn)外，尚需進(jìn)行體外試驗(yàn)。

［1］張杰，李興琴，王素敏，等.車前子對高脂血癥大鼠血脂水平及抗氧化作用的影響［J］.中國新藥雜志，2005，14（3）：299-301.

［2］王素敏，張杰，李興琴，等.車前子對高脂血癥大鼠脂質(zhì)過氧化的影響［J］.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：212-213.

［3］袁從英，熊晨，郭會彩，等.車前子多糖抗脂質(zhì)過氧化作用的研究［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29（10）：1202-1203.

［4］張寧，王素敏，車文文，等.車前子多糖抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖及其機(jī)制［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2009，31（5）：6S3-6SS.

［5］付志紅，謝明勇，聶少平.微波技術(shù)用于車前子多糖的提取［J］.食品科學(xué)，2005，26（3）：151-153.

［6］文娟，王姍姍，牛玉杰，等.異丙莠對小鼠的致突變性研究［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（1）：9-12.

［7］熊晨，王娜，王素敏，等.車前子多糖一般藥理學(xué)研究［J］.白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，200S，6（4）：196-19S.

EXPERIMENTAL STUDY ON THE MUTAGENIC EFFECTS OF PLANTAIN SEED POLYSACCHARID

GUO Hui-cai1，SUN Yao1，WANG Su-min2，NIU Yu-jie1，ZHANG Iong1，WANG Yong-li2*
（1.Department of Toxicology，the School of Public Health，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Pharmacology，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo obServe the mutagenic effectS of plantain Seed polySaccharid（PSP）on miceˊS Somatic cellS and germ cellS.MethodsA total of 100 healthy mice with the body weight between 1S～22g，half male and half female，were randomly divided into five groupS.CyclophoSphamide and diStilled water were given to the mice in poSitive control group and negative control group reSpectively.And in treatment groupS，PSP were given at different doSeS（100mg/kg，200mg/kg and 400mg/kg）.In poSitive control group，cyclophoSphamide waS injected intraperitoneally.In treatment groupS and in negative control group，PSP and diStilled water were given by the gavage at a 24-hour interval for Seven timeS.MicronucleuS and chromoSome aberration rate of bone marrow cellS were obServed.On the other hand，50 male healthy mice（15～1Sg）were divided and treated aS above for the teSt of Sperm abnormality.ResultsThere were no Significant differenceS in micronucleuS of bone marrow cellS，chromoSomal aberration of bone marrow cell and Sperm malformation rate between treament group and negative control group（P＞0.01）.ConclusionPSP have no mutagenic effectS on Somatic cellS and germ cellS.

plantain Seed polySaccharid；mutation；mice

I2S5.5

A

1007-3205（2011）07-075S-03

2011-02-24；

2011-05-03

河北省中醫(yī)藥管理局資助課題（201007S）

郭會彩（1976-），女，河北欒城人，河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院講師，醫(yī)學(xué)博士，從事藥物毒理學(xué)研究。

*通訊作者

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.005