細菌內毒素法檢查銀杏葉提取物注射液的熱原

劉 肅

(廣州市藥品檢驗所,廣東 廣州 510610)

銀杏葉提取物注射液(商品名:金納多)屬心腦血管擴張藥,每支含有銀杏葉提取物17.5mg,其中銀杏黃酮甙4.2μ g。銀杏總黃酮具有擴張冠脈血管、腦血管,改善腦缺血產生的癥狀和記憶功能,對治療冠心病、腦動脈硬化、老年性癡呆等病有一定的療效。

金納多的檢驗標準規定了熱原檢查項目,未收錄細菌內毒素檢查項目。細菌內毒素檢查具有靈敏度高、檢測范圍相對較窄(革蘭氏陰性菌代謝產物)而熱原檢查檢測范圍廣(所有致熱原物質)、靈敏度低等特點。我們在對金納多的熱原檢測基礎上做干擾試驗,并與家兔法進行了比較,以尋找一種簡易可行、準確可靠的檢測方法。

1 儀器與試藥

TW12六孔恒溫水浴(Julabo公司);MSI旋渦混合器(廣州IKA公司)。

細菌內毒素工作標準品(規格:每支120EU,批號:150601-200699)購自中國藥品生物制品檢定所;細菌內毒素檢查用水(BET水 ,規格:每支 50mL,批號:1007161)及鱟試劑(TAL)A(規格:每支 0.1mL,批號:1005071,靈敏度:0.25 EU?mL-1)購自湛江安度斯生物有限公司;TAL B(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司,規格:每支0.1mL,批號:100101,靈敏度:0.25 EU?mL-1);金納多,臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司,批號:EB156,EB108,EB095。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值(L)的確定

本品熱原檢查劑量M=1mL?kg-1,人用每公斤體重每小時可接受的內毒素劑量K=5EU?kg-1,按公式L=K/M=5EU?mL-1,即為金納多的內毒素檢查限度。

2.2 鱟試劑靈敏度復核試驗

按照2010年版《中國藥典》(二部)附錄細菌內毒素檢查法規定,進行鱟試劑的標示靈敏度(λ)復核。結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

由表1可見,兩批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查,λ c均在0.5λ～2.0λ之間,結果均符合規定。

2.3 干擾預試驗

目前用于藥品檢驗的市售鱟試劑靈敏度(λ)一般在0.25 EU?mL-1～0.03 EU?mL-1之間,故金納多進行細菌內毒素檢測時,最大稀釋倍數MVD=CL/λ,分別為 20倍、40倍、80倍、160倍(L=5 EU?mL-1)。取3批金納多,用BET水將供試品稀釋20倍、40倍、80倍、160倍共4個濃度梯度的溶液,將此系列濃度溶液標記為供試品管(NPC系列)。用上述稀釋液作為溶劑,溶解并稀釋細菌內毒素工作標準品,制得每個稀釋度中細菌內毒素含量均為2λ(0.5 EU?mL-1和0.25 EU?mL-1)的金納多溶液,標記此系列溶液為供試品陽性對照管(PPC系列)。取靈敏度為0.25 EU?mL-1的兩個不同廠家的鱟試劑進行試驗,每一稀釋度做2管,同時按常規分別設細菌內毒素陽性對照(PC)和檢查用水陰性對照(NC)各2管,結果見表2。

表2 供試品干擾預試驗結果

從表2結果可見,所用的3批金納多稀釋20倍或更大倍數時,對兩個廠家的鱟試劑反應無增強或抑制的干擾作用。

2.4 正式干擾試驗

用兩個廠家的鱟試劑(靈敏度為0.25EU?mL-1),按中國藥典2010年版二部附錄的細菌內毒素檢查法進行試驗,測定用BET水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值(Es)和用供試品稀釋液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值(Et)。取3批金納多,分別用BET水稀釋20倍,用BET水和供試品稀釋液分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成 2λ、1λ、0.5λ、0.25λ濃度,每一稀釋濃度重復4管,同時用上述供試品稀釋液和BET水各做2管陰性對照管,按公式計算BET水和供試品稀釋液反應終點濃度的幾何平均值(Es和Et),Es=lg-1(∑Xs/4),Et=lg-1(∑Xt/4),結果見表3。

表3 供試品(稀釋20倍)干擾試驗結果

從表3結果可見,2λ、1λ管均為陽性,0.5λ、0.25λ管均為陰性,對于λ=0.25EU?mL-1的2組鱟試劑的Es為0.25 EU?mL-1,3批金納多測得的Et和Es的比值均在0.5～2.0之間,說明金納多在稀釋20倍或更大倍數時對兩個不同廠家的鱟試劑反應無干擾作用,符合中國藥典2010年二部對細菌內毒素檢查有效性的規定,因此可以確定金納多的最大無干擾濃度為稀釋20倍。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

取3批金納多,分別根據“2.4”項下方法制成供試品稀釋液,使用λ=0.25EU?mL-1的兩個廠家的鱟試劑進行細菌內毒素檢查,按中國藥典2010年版二部細菌內毒素檢查法檢查,結果見表4。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果

從表4結果可見,陰性對照管(NC)均為陰性,供試品陽性對照管(PPC)和陽性對照管(PC)均為陽性,實驗有效;供試品管(NPC)均為陰性,表明樣品中未檢出細菌內毒素,3批金納多的細菌內毒素檢查均符合規定。

3 討論

細菌內毒素檢查法因其具有靈敏度高、快速、準確、簡便的特點和優點,目前已被各國藥典所采納,作為替代熱原檢查法的一種檢測方法用于控制藥品的質量。不同廠家的鱟試劑由于生產工藝、質量參數等方面有一定差異,其抗干擾能力存在差異。因此,本實驗采用兩個不同廠家不同靈敏度的鱟試劑對3個批號的樣品進行試驗。從正式干擾試驗結果可見,樣品稀釋20倍時,Es/Et均在 0.5～2.0范圍之內,可認為金納多在該濃度下不干擾細菌內毒素檢查。用兩個廠家鱟試劑與3批樣品進行細菌內毒素檢查,樣品中細菌內毒素限量均在 5EU?mL-1限值以下,符合規定,這與熱原檢查的結果也是一致的。因此,銀杏葉提取物注射液采用限值5EU?mL-1進行細菌內毒素檢查法代替熱原檢查法是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄99.