信號通路抑制劑對兩株子宮內膜癌細胞生物學行為的影響

鄧守恒，吳亞玲，柯賢柱，陳 萍，李 芳，石小燕

子宮內膜癌占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，其發病率逐年上升。Lax等［1］將內膜癌按發病機制分為兩型:Ⅰ型與雌激素相關，占85%;Ⅱ型與雌激素無關，占15%。其中I型最常見的分子水平改變為:人10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白基因 (PTEN)突變缺失及k－RAS基因突變等［2］。已知子宮內膜癌的發生、發展與一些信號通路的活性改變密切相關，其中主要包括表皮生長因子受體 (EGFR)和雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)兩條通路。當前，抑制相關信號通路已成為腫瘤靶向治療的熱點，故本研究擬以PTEN呈不同表達狀態的兩株子宮內膜癌細胞株 (PTEN缺失的Ishikawa細胞和PTEN表達完整的HEC－1A細胞)為研究對象，采用 EGFR及mTOR兩條信號通路抑制劑進行干預，觀察兩株子宮內膜癌細胞的生物學行為改變，探討不同PTEN狀態下兩條信號通路在子宮內膜癌發生、發展中的可能作用，為進一步明確發病機制，合理選擇抗腫瘤藥物提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑和儀器 表皮生長因子 (EGF)、甲基纖維素(CPS4000)、碘化丙錠 (PI)為Sigma產品;EGFR抑制劑RG－14620(RG)、mTOR抑制劑雷帕霉素 (RA)購自美國Biomol公司;DMEM培養基購自美國GIBCO公司;Transwell小室購自美國Costar公司;BMP型倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;Epics Elite ESP型流式細胞儀購自美國Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 兩株子宮內膜癌細胞株 (Ishikawa和HEC－1A)由本院臨床醫學研究所提供，培養于含10%小牛血清的DMEM培養基內，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養。兩株細胞分別經EGF預處理2 h，并分別給予10 μmol/L RG、10μmol/L RA、10μmol/L RG+10μmol/L RA，另設空白對照細胞 (未給予任何信號通路抑制劑)，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 細胞克隆法檢測細胞增殖 參照文獻［3］配制半固體培養基，收集經不同抑制劑處理24 h后的各組細胞，PBS洗去藥物，離心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的培養液稀釋為7.0×103個/ml單細胞懸液，于24孔板預加1.2%甲基纖維素培養基1.0 ml/孔，加入單細胞懸液50μl，使每孔細胞數為350個，每個濃度設4個復孔，混勻后置37℃、5%CO2培養箱中孵育12～14 d后于倒置顯微鏡下計數細胞克隆數，計算細胞存活率 (給藥組平均克隆數/未給藥組平均克隆數×100%)。實驗重復3次。

1.2.3 流式法檢測細胞周期及凋亡 收集消化經不同抑制劑處理24 h后的各組細胞，0.01 mol/L PBS 0.5 ml重懸細胞，加70%乙醇1 ml，－20℃固定24 h，加入PI(終濃度為50 μl/ml)和RNA酶 (終濃度為0.25 mg/ml)，室溫下避光孵育30 min后流式細胞儀做DNA分析，以ModFit LT軟件分析，擬合計算各時相細胞的百分比。

1.2.4 Transwell法分析細胞侵襲性改變 細胞分組及處理同上，在Transwell小室 (Costar公司)中進行，NIH3T3細胞培養液做趨化液，在上室內加入100μl不含胎牛血清的DMEM，37℃孵育1 h，加入上述各組細胞懸液20μl(調細胞濃度為1.0×105個/ml)，每組4個復孔。37℃ 12 h后取出濾膜，甲醇固定，HE染色。顯微鏡下計數濾膜外表面的細胞數，每張濾膜隨機取5個視野 (×200)取均值，實驗重復3次，以相對侵襲抑制率表示腫瘤細胞的侵襲力，相對侵襲抑制率 (%)=(對照組－實驗組)/對照組×100%。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察 未經處理的Ishikawa細胞核大，多形，核仁多個，肥大，胞質內線粒體等細胞器形態正常，經10 μmol/L RG和10μmol/L RA單獨或合用處理24 h后，細胞貼壁能力下降，細胞外形發生改變，許多細胞脫落，細胞數量明顯減少，細胞表面空泡明顯增多，上清液中可見細胞碎片(見圖1)，兩藥合用組效果更為明顯。相比之下，HEC－1A細胞則對上述抑制劑處理不太敏感，細胞外形基本未改變，無明顯凋亡、生長抑制現象發生 (見圖2)。

2.2 兩株子宮內膜癌細胞周期分布、凋亡率比較 RG、RA單獨作用后的Ishikawa細胞G1期細胞比例均較對照Ishikawa細胞呈明顯上升趨勢，S期細胞比例明顯下降 (p＜0.05)，RG、RA合用，Ishikawa細胞 G1期比例上升更明顯 (p＜0.05)，而S期比例則下降更顯著 (p＜0.01)。等劑量的RG、RA單獨或聯合作用HEC－1A細胞后，G1期和S期細胞比例與對照HEC－1A細胞組比較，差異無統計學意義 (P＞0.05)。RG、RA均可誘導 Ishikawa細胞出現凋亡 (p＜0.05)，聯合使用凋亡率更高 (p＜0.01)，而RG、RA單獨或聯合作用對HEC－1A細胞誘導的凋亡作用均不明顯 (P＞0.05)。RG、RA單獨或聯合作用對Ishikawa細胞產生的凋亡率均明顯高于相同處理的HEC－1A細胞組 (p＜0.01，見表1)。

圖1 Ishikawa細胞對EGFR單獨或聯合mTOR信號通路抑制劑的光鏡下表現 (×200)Figure 1 Change of Ishikawa cell morphology after treatment with signal transduction inhibitor

圖2 HEC－1A細胞對EGFR單獨或聯合mTOR信號通路抑制劑的光鏡下表現 (×200)Figure 2 Change of HEC－1A cell morphology after treatment with signal transduction inhibitor

表1 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內膜癌細胞凋亡率和細胞周期分布影響 ，n=4)Table 1 The effect on apoptosis rate and cell phase of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

表1 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內膜癌細胞凋亡率和細胞周期分布影響 ，n=4)Table 1 The effect on apoptosis rate and cell phase of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

注:與Ishikawa組比較，*p＜0.05，△p＜0.01;與Ishikawa+RG組比較，▲p＜0.01;與Ishikawa+RA組比較，☆p＜0.01;與Ishikawa+RG+RA組比較，○p＜0.01

類別 G1期細胞(%)S期細胞(%)M期細胞(%)凋亡率(%)Ishikawa 62.1±2.8 35.4±1.5 3.5±0.9 5.1±0.6 Ishikawa+RG 79.5±2.7 16.3±1.8* 4.2±1.1 25.3±1.2*Ishikawa+RA 77.3±1.9 18.7±2.3* 3.7±1.8 19.7±0.9*Ishikawa+RG+RA 85.2±3.1* 8.3±1.2△ 6.6±1.7 32.7±0.8△HEC－1A 67.2±3.2 31.6±1.7 1.7±0.8 3.7±0.7 HEC－1A+RG 69.5±3.1 29.8±2.1 1.2±0.4 5.4±0.6▲HEC－1A+RA 65.8±3.4 27.4±2.7 5.6±3.4 6.9±0.9☆HEC－1A+RG+RA 71.2±2.3 21.9±2.3 6.7±2.6 7.1±0.5○

2.3 抑制劑對兩株子宮內膜癌細胞存活率和侵襲力的影響RG、RA單獨作用24 h，Ishikawa細胞存活率分別降至 (52.7±5.3)%和 (48.6±4.6)%，與對照Ishikawa細胞存活率相比，差異有統計學意義 (p＜0.05)，RG、RA合用24 h，Ishikawa細胞存活率降至 (28.9±2.7)%，差異有統計學意義(p＜0.01)。RG、RA單獨或聯合作用24 h后的Ishikawa細胞侵襲細胞數目均較對照Ishikawa細胞組顯著下降 (p＜0.01)，細胞侵襲抑制率均明顯增加 (p＜0.01)，RG、RA單獨或聯合作用HEC－1A細胞24 h，細胞存活率、侵襲細胞數目雖較對照HEC－1A細胞有下降趨勢，但差異均無統計學意義 (P＞0.05)。經RG、RA單獨或聯合作用后各組HEC－1A細胞存活率、侵襲細胞數目及侵襲抑制率與相應處理的Ishikawa細胞組比較，差異均有統計學意義 (p＜0.01，見表2)。

表2 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內膜癌細胞存活率和侵襲力影響，n=4)Table2 The effect on survival rate and invasion of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

表2 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內膜癌細胞存活率和侵襲力影響，n=4)Table2 The effect on survival rate and invasion of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

注:與Ishikawa組比較，*p＜0.05，△p＜0.01;與 Ishikawa+RG組比較，▲p＜0.01;與Ishikawa+RA組比較，☆p＜0.01;與Ishikawa+RG+RA組比較，○p＜0.01

類別 存活率 (%)侵襲細胞 (n)抑制率 (%)Ishikawa 100 206±20 0 Ishikawa+RG 52.7± 5.3* 117±12△ 43.3±5.6△Ishikawa+RA 48.6± 4.6* 124±19△ 38.9±7.1△Ishikawa+RG+RA 28.9± 2.7△ 94± 6△ 54.3±4.3△HEC－1A 100 227±14 0 HEC－1A+RG 91.3± 9.5▲ 199±21▲ 12.8±2.2▲HEC－1A+RA 89.8±11.2☆ 205±23☆ 10.4±2.9☆HEC－1A+RG+RA 87.6±10.7○ 187±19○ 17.9±4.7○

3 討論

惡性腫瘤的生物學行為之一是失控性生長，細胞周期出現紊亂導致細胞始終處于增殖狀態而不能進入靜止期以及細胞凋亡受阻是腫瘤細胞失控性生長得以發生的主要機制［4］。惡性腫瘤轉移是指原發灶的腫瘤細胞脫落，隨循環移動后與血管、淋巴管內皮細胞黏附、進而侵襲穿過內皮細胞及其基底膜定植形成轉移灶［5］，是惡性腫瘤的另一生物學行為。

本研究將EGFR抑制劑RG和mTOR抑制劑RA單獨和聯合作用于兩株不同子宮內膜癌細胞，采用經典方法觀察其對細胞生物學行為的影響，結果顯示，RG、RA單獨作用Ishikawa細胞能明顯阻滯細胞周期于G1期并誘導細胞出現凋亡，兩種抑制劑合用則G1期阻滯和細胞凋亡更為顯著，相比之下，HEC－1A細胞則對上述抑制劑處理不太敏感，G1期細胞比例和凋亡率雖有上升趨勢，但均無統計學差異，與鏡下觀察的細胞形態學改變相一致。細胞克隆和侵襲實驗結果顯示，HEC－1A細胞對RG、RA單獨和聯合作用均不敏感，而兩種抑制劑單獨作用后的Ishikawa細胞存活率和侵襲能力均明顯下降，抑制率明顯增加，合用兩種抑制劑則可進一步降低細胞存活率，抑制細胞的侵襲。經RG、RA單獨或聯合作用后的各組Ishikawa細胞存活率、侵襲細胞數目及侵襲抑制率與相應處理的HEC－1A細胞組比較，差異均具有顯著性。

由上述結果可看出，(1)RG、RA單獨或聯合使用均可通過阻滯細胞周期于G1期誘導Ishikawa細胞凋亡，兩抑制劑合用，細胞凋亡率更高。(2)由于克隆形成法可反映出單個細胞的增殖能力，故RG、RA不僅對增殖期Ishikawa細胞具有誘導凋亡作用，而且還對Ishikawa腫瘤干細胞具有明顯的生長抑制作用，這較單純抑制或殺死癌細胞本身具有更大的參考價值［6］。(3)RG、RA均可降低Ishikawa細胞侵襲力，有效抑制細胞的遠處轉移，二者合用作用更強。(4)RG、RA單獨和合用對Ishikawa細胞作用效果明顯，而對HEC－1A細胞相對不明顯，說明EGFR和mTOR信號通路僅在PTEN基因表達缺失時才對抑制劑作用敏感，PTEN基因在整合多條信號通路中發揮著重要作用，可通過影響靶分子及其上下游的信號級聯反應對細胞生物學行為產生影響，這與趙麗君等［7］將HEC－1A細胞PTEN基因敲減后觀察到的細胞生物學行為改變及Blanco等［8］得出的結論一致。

PTEN突變在子宮內膜癌發生中是一個早期事件［9－10］，PTEN在人子宮內膜癌中的突變丟失率可高達60% ～80%［11］，PTEN的丟失又可進一步激活子宮內膜細胞中的磷酸化AKT通路［12］，說明PTEN的缺失突變與子宮內膜癌的形成和發生、發展都有著密切聯系。PTEN基因屬抑癌基因，定位于染色體10q23.3，由9個外顯子和8個內含子構成，其cDNA序列包含由1 209個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼403個氨基酸組成的蛋白質，可通過雙重磷酸酯酶活性負性調控三條途徑(PI3K/AKT/mTOR途徑、FAK途徑和MAPK途徑)來調節細胞生長、增殖、凋亡、細胞遷移、血管生長等。本研究結果提示PTEN基因的表達水平還可成為預測相關信號通路抑制劑敏感與否的標志物之一。腫瘤患者在接受化療前如果能了解此種腫瘤中是哪條或哪幾條信號通路起主要作用，就可能有針對性地應用信號通路抑制劑，提高化療效果。本研究為進一步闡明子宮內膜癌的致病機制，更好地選擇信號通路抑制劑治療目標人群、提高其治療有效率提供了一個新靶向。

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