兒科分離金黃色葡萄球菌耐藥性和耐甲氧西林株的流行病學研究

李穎豐,周暉登

金黃色葡萄球菌 (SA)是引起院內和社區感染的常見病原菌之一,由于抗菌藥物的廣泛應用,耐藥菌株迅速增多,耐藥譜不斷變遷;尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)呈高致病性和多重耐藥,且在世界范圍流行,這給臨床抗感染治療帶來極大困難。隨著耐萬古霉素 MRSA的不斷出現[1-2],MRSA感染的流行已引起高度重視和關注。為了解本地區兒童感染 SA對常用抗菌藥物的耐藥及 MRSA流行情況,本研究對臨床分離 SA兒童株進行耐藥模式和 MRSA隨機擴增多態 DNA分型 (RAPD)研究,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2007年 1月—2009年 12月在廣西壯族自治區婦幼保健院住院患兒送檢的痰、血、尿、咽拭子及傷口分泌物等標本中分離的 SA共 348株,質控菌株 SA AT25923購于衛生部臨檢中心。

1.2 藥物敏感試驗 采用法國梅里埃 ATB半自動微生物鑒定/藥敏分析儀及 GPI藥敏卡進行藥敏試驗,結果判定及質量控制按美國臨床實驗室標準化委員會 (CLSI)2006版標準[3]進行,以苯唑西林最低抑菌濃度 (MIC)＞4μg/ml為 MRSA。β-內酰胺酶檢測采用頭孢硝基噻吩顯色法進行,紙片變為紅色為陽性。

1.3 同源性分析 按試劑盒 (北京賽百盛公司產品)說明書提取 SA染色體 DNA,采用美國 PE公司 5700PCR儀進行擴增,總反應體系為 50μl[10×buffer 5μl,20 mmol/L Mg2+5 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,50 pmol/μl引物 (5-CCG CTA CCGA-3)0.5μl,雙蒸水 36.5μl,模板 2μl],擴增條件:94℃預變性 4 min,94℃變性 60 s、42℃復性 60 s、72℃延伸 60 s,35個循環,72℃延伸 5 min。產物經含溴化乙錠(EB)的 1.2%瓊脂糖凝膠電泳,根據電泳條帶確定型別。

1.4 統計學方法 藥敏資料采用 WHONET 5.4軟件進行分析。

2 結果

2.1 SA分布率 檢出 SA的標本主要來自新生兒科 37.93%(132株),其次為兒科 PICU 27.01%(94株),呼吸科18.97%(66株),兒外科 10.63%(37株),兒內科 5.46%(19株)。各類標本中檢出 SA最多的為痰液 42.53%(148株),其次為傷口分泌物 24.14%(84株),血液 13.79%(48株),咽拭子 10.34%(36株),尿液 7.18%(25株),其他2.02%(7株 )。

2.2 SA耐藥性總體情況 348株 SA中,334株產 β-內酰胺酶,對青霉素和阿莫西林/棒酸耐藥較高,分別為 100.00%和49.14%;對其余 β-內酰胺酶類抗菌藥物耐藥率較低,為6.03%～12.93%。耐藥率較低的有呋喃妥因、利福平、左氧氟沙星和環丙沙星,為 3.74%～16.38%;耐藥率較高的有四環素、復方新諾明、克林霉素和大環內酯類,為 43.97%～65.23%;未發現對萬古霉素、替考拉林和利奈唑胺耐藥株。具體見表1。

表1 348株 SA對常用抗菌藥物的耐藥性 (%)Table 1 The antibiotic resistance of 348 isolates staphylococcus aureus

2.3 MRSA與 MSSA耐藥性比較 348株 SA中檢出 MRSA 34株,MRSA、MSSA(甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌)對青霉素耐藥率均為 100.00%,對萬古霉素、替考拉林、利奈唑胺、呋喃妥因和利福平耐藥率均較低,為 0～8.82%,而對其余 17種抗菌藥物耐藥率 MRSA均高于 MSSA。具體見表1。

2.4 MRSA同源性分析 經 RAPD分型,可見 1～11條基因條帶,共分為 6個基因型 (見圖1)。其中Ⅰ型 22株,Ⅱ型 5株,Ⅲ型 1株,Ⅳ型 3株,Ⅴ型 2株,Ⅵ型 1株,以Ⅰ型感染為主 (64.71%)。不同 MRSA基因分型的科室分布見表2。

表2 34株 MRSA-RAPD基因分型臨床科室分布Table 2 The clinical distribution of RAPD analyses of 34 Methicillin-resistant staphylococcus aureus

圖1 MRSA-RAPD基因分型圖譜Figur e 1 Fingerprint of RAPDanalyses of MRSA

3 討論

SA能產生多種毒素及酶,是引起臨床感染的重要病原菌。常見的感染有外科切口等局部化膿性感染和肺炎、心內膜炎、敗血癥、膿毒癥等全身感染。本研究結果顯示,SA主要分離自呼吸道標本痰液和咽拭子,其次為傷口分泌物,血液也有較高的檢出率 (13.79%),表明呼吸道仍是本院兒科 SA感染的首發部位。從分布來看,主要來自新生兒科、兒科 PICU和呼吸科,表明這些科室易發生 SA感染[4]。其中新生兒科所占比例最高,這與新生兒免疫系統尚未成熟、對環境中的 SA高度易感有關。

耐藥監測顯示,348株 SA未發現對糖肽類、噁唑烷酮類代表藥物利奈唑胺耐藥株,表明這些藥物仍是 SA感染重癥患兒治療首選和最有效的藥物。其中利奈唑胺作為一種新藥,臨床在使用時應做好耐藥性監測,避免濫用[5]。喹諾酮類、頭孢類、利福平、呋喃妥因的耐藥率也較低,表明這些藥物對SA有較好的抗菌活性。但喹諾酮類藥物可在 3～4 d內產生耐藥,應注意耐藥性監測。348株 SA中334株 SA產 β-內酰胺酶,對青霉素的耐藥率為100.00%,對其余 β-內酰胺類藥物耐藥率為 6.03%～49.14%。值得注意的是,苯唑西林耐藥率為 9.77%,與頭孢菌素類耐藥率 8.62%～12.93%無差異;表明治療 SA感染頭孢菌素類并不比苯唑西林優越,苯唑西林仍是治療兒童 SA感染的敏感藥物。四環素、大環內酯類、阿莫西林/棒酸、復方新諾明和克林霉素耐藥率較高,均大于40%,表明這些藥物不宜用于 SA感染的治療。阿莫西林/棒酸作為 β-內酰胺酶抑制劑,其耐藥率卻遠高于除青霉素外的β-內酰胺類藥物及哌拉西林/他唑巴坦,導致這種差異可能與用藥習慣相關,是否與耐酶抑制劑廣譜酶 (IRBL)產生有關,還需進一步研究。

348株 SA中 MRSA檢出率為 9.77%,與本地區8.30%[6]、上海 9.7%[7]相近,低于 Mahnarin 2008年度報告 0～14歲兒童的 32.7%[8],遠低于 Mohnarin 2008年度報告的52.3～76.9%[9],表明 MRSA檢出率在不同地區和人群中差異較大。這可能與不同地區用藥習慣不同,病例年齡構成、標本來源等有關。本組 348例標本均來自住院患兒,新生兒及嬰幼兒所占比例較大,MRSA檢出較低可能與臨床用藥比較謹慎有關。MRSA對所有 β-內酰胺類藥物均有不同程度耐藥,耐藥率 23.53%～100.00%,這與 MRSA染色體攜帶的 mecA基因編碼與 β-內酰胺類抗菌藥物親和力極低的替代性青霉素結合蛋白有關。同時 mec基因可整合紅霉素、四環素等多種耐藥基因,導致其對紅霉素和四環素呈高度耐藥性[10]。本研究中MRSA對四環素和紅霉素耐藥率均高達 82.35%,其中對大環內酯類 3種抗菌藥物同時耐藥。對萬古霉素、替考拉林、利奈唑胺、呋喃妥因和利福平耐藥率與 MSSA無差異,對其余抗菌藥物耐藥率均高于 MSSA。

近年來,MRSA引起的嚴重感染在全球范圍內迅速增加,常有暴發流行的報道。因此,如何有效預防和控制 MRSA感染已迫在眉睫。目前主要應用 RAPD和脈沖場電泳對細菌進行基因分型,以了解其流行情況。RAPD是通過 PCR介導使所有與隨機引物互補的模板基因組 DNA得到擴增,產生一系列大小不同的 DNA片段,經電泳呈現出不同的 DNA指紋圖進行分型。脈沖場電泳被視為細菌基因分型的金標準,分辨力高,且易標準化;但樣本制備繁瑣,且需要特殊的電泳儀器,電泳耗時長。而 RAPD方法經濟、簡便、快速、靈敏,最大特點在于靶基因序列未知情況下設計任意 10個堿基單鏈寡聚核苷酸片段引物,其分型結果與脈沖場電泳基本一致,可作為細菌分子生物學流行病學研究的可靠方法。

本研究應用 RAPD方法對分離的 34株 MRSA進行基因分型,共分為 6個基因型,其中以Ⅰ型感染為主 (64.71%)。兒科 PICU分離的 MRSA菌株最多,以Ⅰ型感染為主。研究發現該病區存在 MRSA暴發[11],暴發病例為 6例,且存在 2個基因型的 MRSA流行;聚集性病例為3例,其余均為散發性病例,這主要與 ICU患兒住院時間較長、侵襲性操作、使用抗菌藥物、合并感染和其他神經癥狀等均大大增加了感染 MRSA的幾率[12]。新生兒科、呼吸科、兒外科和兒內科分離得 MRSA菌株較少,且分布也較分散;但除有各自不同的基因型外,還存在與兒科 PICU相同的基因型,可能上述科室與兒科 PICU間時有患兒轉入或轉出有關。

總之,在對感染 SA患兒抗感染治療的同時,應加強細菌耐藥性監測,及時掌握耐藥性變遷,正確、合理地使用抗菌藥物,是預防耐藥性進一步蔓延的有效措施。同時,采用 RAPD方法對 MRSA進行同源性分析,對有效控制醫院感染、確定MRSA引起的感染暴發及其傳播途徑有重要意義。

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