99Tcm-硫化錸膠體用于前哨淋巴結(jié)檢測(cè)的生物實(shí)驗(yàn)——注射劑量與明膠濃度的影響

李洪玉,梁積新,羅洪義,陳寶軍,楊春慧,鄭德強(qiáng)

(中國(guó)原子能科學(xué)研究院同位素研究所,北京 102413)

前哨淋巴結(jié)(SLN)是接受原發(fā)腫瘤淋巴回流的第一個(gè)或笫一組淋巴結(jié),是最早可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的特異淋巴結(jié)。放射導(dǎo)向的前哨淋巴結(jié)活組織切片檢查(SLNB)是一種在早期乳腺癌和黑色素瘤處置方面被廣泛認(rèn)可的技術(shù),尤其在腫瘤發(fā)病初期,用于檢測(cè)位于隱匿性區(qū)域的前哨淋巴結(jié)并對(duì)其是否發(fā)生癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行評(píng)估,對(duì)治療方案的選擇具有重要意義[1-6]。

目前用于SLNB的放射性顯像劑主要是納米型藥物,有99Tcm-硫化錸膠體、99Tcm-經(jīng)過(guò)濾的硫膠體和99Tcm-HSA[7]。這類(lèi)顯像劑在前哨淋巴結(jié)的攝取是基于淋巴結(jié)對(duì)藥物微粒的生理俘獲,這是一個(gè)可飽和的過(guò)程,藥物顆粒的大小和給藥區(qū)域的表面性質(zhì)會(huì)影響藥物從注射點(diǎn)引流至毛細(xì)淋巴管的速率及淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞吞噬藥物的速率。比如,分子顆粒較大時(shí),藥物進(jìn)入淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的速率會(huì)相對(duì)慢些,而其在注射點(diǎn)和前哨淋巴結(jié)的滯留會(huì)相對(duì)多些;微粒直徑在20 nm以下的分子則不適于前哨淋巴結(jié)顯像,因?yàn)樗鼈儠?huì)很快被引流至下一級(jí)淋巴結(jié)。顆粒度為100 nm左右的膠體藥物顆粒較易進(jìn)入到毛細(xì)淋巴管并被巨噬細(xì)胞吞噬而滯留在淋巴結(jié),而更大的顆粒則會(huì)被胞間隙俘獲。因此,該類(lèi)藥物可能存在一些缺點(diǎn),如:在注射點(diǎn)有高濃集、分子顆粒大小不均、易發(fā)生放射性從SLN到2LN的遷移等[8]。99Tcm-硫化錸膠體是一種粒徑范圍在20～400 nm,并在100 nm有較高分布的藥物。

本工作擬采用藥盒法制備99Tcm-硫化錸膠體,并將其稀釋后再注入小鼠體內(nèi),考察注射劑量及穩(wěn)定劑濃度對(duì)99Tcm-硫化錸膠體在小鼠淋巴結(jié)放射性攝取及體內(nèi)生物分布的影響,為開(kāi)發(fā)新型淋巴結(jié)顯像藥物提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

99Mo-99Tcm發(fā)生器:原子高科股份有限公司產(chǎn)品;FH 463A自動(dòng)定標(biāo)器、FT-603型閃爍探頭:北京核儀器廠產(chǎn)品;CRC15R 放射性活度計(jì):美國(guó)CAPINTEC公司產(chǎn)品;微量注射器:美國(guó)Hamilton公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/C 小白鼠:60只,雄性,18～22 g,清潔級(jí),由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 99 Tcm-硫化錸膠體室溫穩(wěn)定性

將標(biāo)記溶液原液于室溫下靜置5 h,分別于1、2、3、4、5 h采用紙層析分析法分析其放化純度。

2.2 注射劑量對(duì)生物分布的影響

用生理鹽水注射液對(duì)99Tcm-硫化錸膠體溶液進(jìn)行 10、100、500、715倍稀釋 。

將60只Balb/C小白鼠隨機(jī)分為5個(gè)劑量組,每劑量組12只,每劑量組又分為兩組(每組6只),分別于給藥后1、4 h處死。每組小鼠由后腳墊皮下注射5μL99Tcm-硫化錸膠體及不同稀釋倍數(shù)99Tcm-硫化錸膠體稀釋液,99Tcm-硫化錸膠體的注射劑量依次為0.343、3.43×10-2、3.43×10-3、6.86×10-4、4.80×10-4μg,按摩腳掌0.5 min;在給藥一側(cè)的腳墊處皮下注入專(zhuān)利藍(lán)溶液,再按摩腳掌0.5 min,以便解剖時(shí)獲取淋巴結(jié)位點(diǎn)。注入專(zhuān)利藍(lán)溶液10 min后處死小鼠,取腘窩淋巴結(jié)(SLN)、腰淋巴結(jié)(次級(jí)淋巴結(jié),2LN)、注射點(diǎn)(后足)、肝、脾、血 ,測(cè)量放射性計(jì)數(shù),計(jì)算放射性攝取率(%ID/g)及腘窩淋巴結(jié)提取率,計(jì)算公式如下:

腘窩淋巴結(jié)提取率體現(xiàn)了藥物在第一淋巴結(jié)滯留的比率,該值越大,說(shuō)明藥物向下一級(jí)淋巴結(jié)遷移的可能性越小。

2.3 注射體積的影響

Balb/C小白鼠12只,隨機(jī)分為2組(每組6只),將上述進(jìn)行715倍稀釋的溶液再稀釋4倍,之后由小鼠后腳墊皮下注射20μL,分別于注后1、4 h處死小鼠,其它步驟同2.2節(jié)。比較注射化學(xué)量為4.80×10-4μg時(shí),注射體積為5μL和20μL對(duì)99Tcm-硫化錸膠體生物分布的影響。

2.4 明膠濃度的影響

用濃度為3 g/L的明膠溶液對(duì)標(biāo)記原液進(jìn)行100倍的稀釋,溶液中明膠濃度約0.03 g/L。取12只Balb/C小白鼠,隨機(jī)分為2組,每組6只,由小鼠后腳墊皮下注射5μL該稀釋液,分別于注射后1、4 h處死小鼠,其他步驟同2.2節(jié)。考察注射劑量為3.43×10-3μg時(shí),明膠濃度對(duì)99Tcm-硫化錸膠體生物分布的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 99 Tcm-硫化錸膠體室溫穩(wěn)定性

99Tcm-硫化錸膠體溶液室溫放置5 h,放化純度未見(jiàn)下降低,均在95%以上。

3.2 生物分布

99Tcm-硫化錸膠體的注射劑量對(duì)其在小鼠淋巴結(jié)及體內(nèi)分布的影響列于表1。腘窩淋巴結(jié)提取率隨注射劑量及時(shí)間的變化列于表2。

表1 注射劑量對(duì)小鼠體內(nèi)生物分布的影響(,n=6)

表1 注射劑量對(duì)小鼠體內(nèi)生物分布的影響(,n=6)

注射后時(shí)間 組織放射性攝取率/(%ID·g-1)反應(yīng)原液 稀釋10倍 稀釋100倍 稀釋500倍 稀釋715倍SLN 5.59±0.84 2.86±0.77 2.77±0.99 2.11±0.11 1.76±0.70 2LN 4.07±0.75 1.04±0.39 0.71±0.55 0.29±0.10 0.54±0.22 1 h 注射點(diǎn) 49.12±3.11 46.25±3.84 64.45±2.88 67.86±2.34 66.02±3.19肝 11.78±1.73 2.29±0.57 1.57±0.37 0.98±0.10 1.15±0.27脾0.26±0.01 0.07±0.01 0.13±0.04 0.12±0.03 0.14±0.08血2.25±0.13 0.74±0.10 0.72±0.14 0.88±0.10 0.66±0.18 SLN 8.47±2.13 5.63±1.34 5.05±0.93 2.04±0.47 1.88±0.28 2LN 4.89±1.19 1.19±0.19 0.84±0.44 0.47±0.06 0.36±0.14 4 h 注射點(diǎn) 48.61±3.27 52.43±2.52 64.15±3.85 70.65±3.10 71.12±1.63肝9.65±1.44 2.54±0.30 1.66±0.79 0.97±0.11 0.95±0.18脾0.24±0.04 0.07±0.01 0.15±0.04 0.14±0.03 0.17±0.04血1.15±0.07 0.50±0.28 0.69±0.23 0.88±0.11 0.81±0.23

表2 注射劑量對(duì)腘窩淋巴結(jié)提取率的影響(,n=6)

表2 注射劑量對(duì)腘窩淋巴結(jié)提取率的影響(,n=6)

腘窩淋巴結(jié)提取率/%注射后時(shí)間反應(yīng)原液 稀釋10倍 稀釋100倍 稀釋500倍 稀釋715倍1 h 27.2 63.6 74.4 86.3 69.3 4 h 42.3 78.9 83.4 77.0 80.9

由表1可知,注射99Tcm-硫化錸膠體原液后,近50%的99Tcm-硫化錸膠體滯留在注射點(diǎn)處,(由粒徑較大的藥物顆粒引起),但這并不影響未滯留的藥物進(jìn)入淋巴引流至SLN,在SLN的攝取于注射后4 h約8.5%,此時(shí)淋巴結(jié)處于一種過(guò)飽和狀態(tài),因此不能滯留的藥物顆粒會(huì)經(jīng)淋巴管進(jìn)入血液,并最終停留在肝和脾內(nèi),因此肝的攝取率較高。

注射稀釋后的標(biāo)記溶液后,被注射的藥物顆粒數(shù)降低,則在前哨淋巴結(jié)的攝取未達(dá)到飽和狀態(tài),因此腘窩淋巴結(jié)的放射性會(huì)相應(yīng)降低,且僅有少量膠體顆粒會(huì)進(jìn)入血液,因此,肝和血液中的攝取也相應(yīng)減少。

由表2可以看出,腘窩淋巴結(jié)提取率隨劑量減小而升高,且隨時(shí)間延長(zhǎng)升高。

注射體積及明膠濃度對(duì)99Tcm-硫化錸膠體在淋巴結(jié)及小鼠體內(nèi)分布的影響列于表3。明膠是一種分散劑,在NANOCIS?藥盒中起著穩(wěn)定劑的作用,用于防止膠體顆粒相互聚集形成聚合體,而大顆粒的聚合體往往會(huì)滯留在注射點(diǎn)并造成注射點(diǎn)的高濃集,這也是稀釋后注射點(diǎn)的滯留反而會(huì)增大的原因。由表3可知,將溶液中明膠的濃度由0.03 g/L增加至3 g/L時(shí),SLN的放射性攝取有大幅提高,但2LN的放射性攝取同時(shí)也有較大提高;肝攝取上升了近10倍;注射點(diǎn)的放射性攝取降低,給藥4 h后,降低更為明顯,由64.15%降至 41.77%。注后1 h,腘窩淋巴結(jié)提取率的降低顯著,由74.4%降至27.2%。

在同一個(gè)時(shí)相,注射體積由 5μL增加到20μL時(shí),SLN的放射性攝取有所降低,在注射4 h后由1.88%ID·g-1降至1.08%ID·g-1;在注射點(diǎn)的濃集則有約5%的增加;腘窩淋巴結(jié)提取率在注后1 h基本不變,而在注后4 h,由80.9%降至52.8%。這是由于單位體積內(nèi)藥物顆粒數(shù)降低,在前哨淋巴結(jié)的攝取不能達(dá)到飽和狀態(tài),因此腘窩淋巴結(jié)的放射性會(huì)相應(yīng)降低,且僅有少量膠體顆粒會(huì)進(jìn)入血液,因此,肝和血液中的攝取也相應(yīng)減少。

注射體積增大,過(guò)量的溶劑會(huì)對(duì)淋巴結(jié)產(chǎn)生占位飽和效應(yīng),使得其對(duì)藥物的攝取降低,另外,在動(dòng)物腳掌這樣一個(gè)相對(duì)狹小的范圍里皮下注射,注射的體積過(guò)大,不利于藥物的吸收,且容易引起注射點(diǎn)發(fā)炎滲水的現(xiàn)象。因此,應(yīng)在合理范圍內(nèi)盡可能減少注射體積。

表 3 注射體積及明膠濃度對(duì)體內(nèi)分布的影響(,n=6)

表 3 注射體積及明膠濃度對(duì)體內(nèi)分布的影響(,n=6)

注:1)為溶液中明膠的濃度為0.03 g/L;2)為溶液中明膠的濃度為3 g/L

放射性攝取率/(%ID·g-1)注射后時(shí)間 組織5μL 20μL 5μL1) 5μL 2)SLN 1.76±0.70 1.71±0.51 2.77±0.99 3.38±0.86 2LN 0.54±0.22 0.53±0.18 0.71±0.55 2.46±0.47 1 h 注射點(diǎn) 66.02±3.19 70.70±3.46 64.45±2.88 56.39±2.81肝1.15±0.27 1.45±0.32 1.57±0.37 10.19±1.12脾0.14±0.08 0.19±0.02 0.13±0.04 0.28±0.08血0.66±0.18 0.91±0.17 0.72±0.14 1.60±0.30 SLN 1.88±0.28 1.08±0.38 5.05±0.93 9.69±1.98 2LN 0.36±0.14 0.51±0.21 0.84±0.44 3.80±1.93 4 h 注射點(diǎn) 71.12±1.63 77.41±1.76 64.15±3.85 41.77±5.45肝0.95±0.18 1.32±0.32 1.66±0.79 12.44±4.44脾0.17±0.04 0.19±0.04 0.15±0.04 0.40±0.12血0.81±0.23 1.40±0.71 0.69±0.23 0.65±0.09

5 小 結(jié)

注射體積增大,會(huì)造成淋巴結(jié)對(duì)藥物的攝取降低;注射劑量減少,雖然在淋巴結(jié)的攝取減少,但腘窩淋巴結(jié)提取率卻有較大提升,并且在肝和血液中的攝取也會(huì)降低;稀釋后保持穩(wěn)定劑明膠的濃度與原液中的濃度相當(dāng)時(shí),SLN的放射性攝取有大幅提高,但腘窩淋巴結(jié)提取率卻顯著降低,而且肝攝取也有大幅提高。

注射劑量是影響該類(lèi)藥物在小鼠淋巴結(jié)體內(nèi)生物分布的關(guān)鍵因素,注射劑量和注射體積之間也存在一定的交互作用,因此,應(yīng)在可行的前提下盡量降低注射體積,同時(shí)在進(jìn)行注射劑量的選擇時(shí),應(yīng)綜合考慮注射劑量及明膠濃度對(duì)SLN、2LN及注射點(diǎn)的攝取所產(chǎn)生的效應(yīng)。

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