NGR短肽的188Re標記及其在荷瘤裸鼠體內的生物分布和SPECT顯像

鎖耀宇,楊衛東,馬曉偉,汪 靜

(第四軍醫大學 西京醫院核醫學科,陜西 西安 710032)

以腫瘤血管作為靶點對腫瘤進行靶向性研究是腫瘤診斷和治療的一個重要策略。含有特異序列的多肽RGD和NGR等是針對腫瘤血管的特異性配體,目前已成為腫瘤靶向性研究的熱點。

腫瘤血管生成是腫瘤生長的關鍵環節[1-2],腫瘤新生血管的形成受CD13、αvβ3整合素(Integrin)等多種蛋白分子的調控。αvβ3整合素在多種腫瘤細胞表面和新生血管內皮細胞內高表達[3-4],含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的多肽能與αvβ3高度特異性結合。放射性核素標記RGD多肽用于腫瘤顯像和治療的研究已有多篇報道[5-7]。CD13(氨肽酶N)是一種跨膜蛋白酶。研究表明,與αvβ3整合素一樣,CD13表達于腫瘤新生血管內皮細胞,在正常組織血管內皮細胞中低表達或不表達[8]。因此CD13可以作為腫瘤靶向性研究的一個理想靶位。NGR是應用噬菌體隨機多肽庫技術篩選的一個核心序列為天冬酰胺(Asparagine,N)、甘氨酸(Glycine,G)、精氨酸(Arginine,R)的多肽,能與腫瘤新生血管內皮細胞的CD13特異結合[9]。因此,國內外已有學者將NGR作為載體與腫瘤壞死因子(TNF)、脂質體、血管形成抑制因子以及干擾素等多種藥物耦聯進行腫瘤顯像、治療以及療效評價的研究[10-13]。研究[14-15]表明,以腫瘤新生血管內皮細胞CD13為靶點,能夠明顯提高藥物的靶向性和抗腫瘤效果。188Re半衰期短,可發射穿透距離短、具有適宜治療的β射線和適于顯像的γ射線,且制備簡易可行,可作為腫瘤放免導向治療核素[16-17]。本工作擬制備15肽的188Re-NGR,并研究其在荷HepG2肝癌細胞的嚴重聯合免疫缺陷(SCID)裸鼠模型體內的生物分布和SPECT顯像。

1 主要實驗材料

1.1 試劑和儀器

NGR:純度＞98%,西安第四軍醫大學生物技術中心制備;二巰基乙醇:美國Sigma公司產品;SnCl2·2H2O、葡萄糖酸鈉:北京化學試劑公司產品。其他試劑均為國產分析純。

188W-188Re發生器:原子高科股份有限公司產品;GF254層析硅膠板、Sep-Pak C18反相萃取柱:美國Waters公司產品;Mini-Scan型放射性薄層掃描儀:美國Bioscan公司產品;單道γ計數儀:西安志達科技有限公司產品;SPECT/CT:德國西門子公司產品。

HePG2肝癌細胞株:上海復旦大學中山醫院腫瘤研究所提供。

1.2 實驗動物

嚴重聯合免疫缺陷(SCID)裸鼠:約30 g,30只,清潔級,4～6周齡,中國科學院上海實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 188Re-NGR的制備

[18]的方法,并略加改動制備得到188Re-NGR。NGR的化學結構示于圖 1,188Re-NGR制備流程示于圖2。具體方法為:在40μg NGR中加入二巰基乙醇(二巰基乙醇與NGR摩爾濃度比約為1 000∶1),混勻后室溫放置 30 min,加入200μL 0.2 mol/L p H 6.0的醋酸鈉緩沖液,5 mg葡萄糖酸鈉溶液,30μL氯化亞錫溶液(3.0 g/L,0.1 mol/L HCl溶解)和37 MBq Na188ReO4溶液,混勻,室溫下放置2 h,完成標記。

2.2 188Re-NGR的標記率及放化純度的測定

用薄層層析法(TLC)測定188Re-NGR標記率。采用GF254層析硅膠板作為固定相,分別以丙酮、生理鹽水、V(乙醇)∶V(水)∶V(氨水)=2∶5∶1為流動相展開。根據不同展開體系中所得到各標記物放射性計數,分別以下式計算標記率及標記物比活度:標記率=[(188Re-NGR+188Re-膠體+188Re-配體)放射性計數/總放射性計數]×100%-(188Re-膠體+188Re-配體)放射性計數/總放射性計數×100%;比活度(PBq/g)=188ReO4-放射性活度(TBq)×標記率÷NGR質量(mg)。

標記物經Sep-Pak C18柱進行純化后,TLC法測定放化純度。Sep-Pak C18柱純化:用10 mL蒸餾水飽和Sep-Pak C18柱,并用10 mL無水乙醇淋洗Sep-Pak C18柱進行活化。將準備好的188Re-NGR溶液加入Sep-Pak C18柱中,以10 mL的蒸餾水將未反應完的188ReO4-洗去,用氮氣吹干硅膠柱后,以1 mL的80%乙醇淋洗Sep-Pak,此部分為188Re-NGR。TLC法測定放化純度的條件與測標記率的相同。

圖1 NGR的化學結構示意圖

圖2 188 Re-NGR制備流程示意圖

2.3 188Re-NGR穩定性測定

取200μL188Re-NGR,用 500μL的小牛血清稀釋,于 37 ℃下保存 ,分別于 0、0.5、1、2、4、8、12、24 h取少量樣品測放化純度。

2.4 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內生物分布

將30只腫瘤直徑約 0.8～1.0 cm的荷Hep G2瘤裸鼠模型隨機分成 6組,每組 5只,經尾靜脈注射0.2 mL(7.4 MBq)188Re-NGR,于注射后1、2、4、8、12、24 h 按組將小鼠處死。另取5只荷HePG2瘤裸鼠作為競爭性抑制組,于注射188Re-NGR前1 h先注射未標記的NGR(NGR與188Re-NGR摩爾比為10∶1),并于注射188Re-NGR后12 h處死。取血及主要臟器,稱取臟器質量并測量放射性計數,經衰減校正后計算每克組織的放射性攝取率(%ID/g)。并計算靶組織(T)與非靶組織(NT)的放射性攝取比(T/NT)。

2.5 SPECT顯像

取3只荷 HePG2瘤裸鼠,經尾靜脈注射0.2 mL(7.4 MBq)188Re-NGR,另取3只作為競爭性抑制組,注射188Re-NGR前1 h先注射未標記的NGR(NGR與188Re-NGR摩爾比為10∶1),并于注射后 1、2、4、8 、12、24 h 進行靜態顯像,使用針孔準直器,矩陣 128×128,Zoom 1.33,每幀采集30 min。

3 結果與討論

3.1 188Re-NGR的制備

該直接標記法中以SnCl2快速還原188ReO4-,并采用葡萄糖酸鈉作為中間配體,與188Re保持弱絡合作用,將188Re保持在穩定的低價態,保證了188Re與還原后的NGR配位交換反應的順利進行。經TLC法測定,標記物中各成分的Rf列于表1。根據表1中各物質的Rf計算可知,188Re-NGR的標記率＞85%。

表1 標記液中各成分在不同展開體系中的R f

經Sep-Pak C18反向萃取柱純化,188Re-NGR的放化純度＞90%。188Re-NGR比活度為(0.79±0.02)TBq/g。188Re-NGR 在 37 ℃小牛血清中放置 0 、0.5 、1、2、4、8、12、24 h 后 ,放化純度分別為 93.0%、91.8%、89.4%、88.9%、85.3%、82.0%、80.6%、65.7%,因此188Re-NGR可在體外穩定存放2 h。

3.2 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠體內生物分布

188Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內的生物分布列于表 2,由表2可知,188Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠血液中清除較快,注射后1 h放射性攝取為(2.53±0.21)%ID/g,注射后24 h為(0.19±0.02)%ID/g;注射后1～12 h腎臟攝取始終保持在約10%ID/g,標記物在肝臟和腸道中亦有較高攝取,提示188Re-NGR主要經腎臟排泄,其次為消化道;腫瘤組織 12 h攝取為(4.62±0.71)%ID/g,24 h時攝取仍有(2.01±0.38)%ID/g,表明188Re-NGR在腫瘤組織內停留時間較長;骨骼肌等非靶組織攝取少且清除快。在競爭性抑制組中,12 h時腫瘤組織放射性攝取為(1.43±0.61)%ID/g,明顯低于實驗組。

表2 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內生物分布(,n=5)

表2 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內生物分布(,n=5)

組織或器官放射性攝取/(%ID·g-1)1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 抑制組(12 h)血液 2.53±0.21 1.52±0.19 1.05±0.24 0.96±0.15 0.68±0.05 0.19±0.02 1.22±0.37心臟 1.73±0.13 2.68±0.51 1.62±0.14 1.53±0.18 1.21±0.26 0.52±0.14 1.37±0.40肺 1.21±0.31 1.39±0.23 1.14±0.27 1.07±0.09 0.83±0.20 0.28±0.06 0.97±0.52肝 7.15±0.53 9.12±0.81 8.21±0.33 6.51±0.60 6.28±0.45 4.75±0.42 5.16±1.04脾 1.82±0.22 2.11±0.30 1.57±0.15 1.12±0.31 0.94±0.11 0.51±0.23 1.20±0.29腎 9.51±0.62 10.84±0.42 14.05±0.68 14.73±0.84 11.92±0.39 4.03±0.34 15.82±0.70胃 1.02±0.24 1.62±0.16 1.04±0.41 0.84±0.12 0.53±0.08 0.31±0.07 0.91±0.53腸道 3.11±0.61 7.51±0.67 6.85±0.73 5.01±0.41 4.16±0.56 2.06±0.29 4.55±0.47肌肉 1.25±0.20 1.24±0.25 1.16±0.13 1.10±0.21 0.97±0.34 0.94±0.15 1.33±0.27腫瘤 2.84±0.51 3.12±0.72 3.55±0.21 3.98±0.37 4.62±0.71 2.01±0.38 1.43±0.61

表3 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠中的T/NT,n=5)

表3 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠中的T/NT,n=5)

組織或器官T/NT 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 抑制組(12 h)腫瘤與肌肉 2.27±0.31 2.52±0.20 3.06±0.49 3.62±0.55 4.76±0.36 2.14±0.11 1.08±0.24心臟與肌肉 1.38±0.21 2.16±0.35 1.40±0.16 1.39±0.41 1.25±0.22 0.56±0.19 1.03±0.11肺與肌肉 0.97±0.22 1.12±0.30 0.98±0.17 0.95±0.21 0.86±0.14 0.31±0.09 0.80±0.26肝與肌肉 5.72±1.03 7.35±0.94 7.08±1.08 5.92±0.61 6.47±0.42 5.10±0.27 3.89±0.80脾與肌肉 1.46±0.12 1.71±0.18 1.34±0.09 1.01±0.06 0.96±0.20 0.55±0.14 0.89±0.11腎與肌肉 7.61±0.70 8.73±0.68 12.10±0.43 13.41±0.37 12.28±0.62 4.32±0.20 11.90±0.58胃與肌肉 0.81±0.19 1.31±0.22 0.90±0.15 0.76±0.26 0.55±0.11 0.34±0.17 0.69±0.20腸與肌肉 2.48±0.31 6.05±0.58 5.90±0.42 4.55±0.39 4.28±0.41 2.19±0.25 3.42±0.52

2.3 荷HePG2瘤裸鼠的SPECT顯像

荷HePG2瘤裸鼠注射188Re-NGR后的SPECT顯像示于圖3。188Re-NGR在荷 HepG2瘤裸鼠中的 T/NT列于表 3。由表3可知,注射188Re-NGR后 1 h腫瘤即可顯影,其中,腎、胃及腸道等組織攝取量較高,隨時間延長,腹腔本底、血液及肌肉等組織攝取降低,腫瘤的攝取逐漸增多,T/NT也隨之增高。12 h腫瘤T/NT為4.76,其顯像最為清晰,24 h仍有顯影。圖3顯示,在4～8 h顯像清晰,競爭性抑制組注射188Re-NGR后腫瘤未顯影。該結果表明,腫瘤對188Re-NGR的攝取是通過受體介導的特異性攝取。

圖3 荷Hep G2瘤裸鼠188 Re-NGR SPECT顯像

3 小 結

(1)本工作采用中間配體交換的方法進行188Re-NGR的制備,該反應時間短,易于完成,標記率可達85%,放化純度＞90%,能夠滿足體內外受體研究要求,標記物在體外能穩定存放2 h。

(2)188Re-NGR主要通過腎臟代謝,部分經腸道代謝;在腫瘤組織中有明顯攝取,且存留時間較長;抑制組對188Re-NGR的攝取明顯低于實驗組,且腫瘤部位不顯像。以上結果說明,腫瘤對188Re-NGR的攝取是通過受體介導的特異性攝取。

(3)188Re-NGR注入荷瘤裸鼠體內后4 h即可顯像。

188Re-NGR不僅可用于腫瘤顯像,亦能為進行腫瘤治療的適應征選擇及療效評價提供依據。

由于188Re的半衰期較短,可防止高能β射線對骨髓等正常組織可能引起的損傷,并可采用多次給藥的方式以提高療效。NGR可與多種藥物耦聯,可提高靶向性。因此,今后將著力進行188Re標記 NGR-IFN及NGR-VEGI等融合蛋白的腫瘤顯像及治療研究。

參考文獻:

[1] Bergers G,Benjamin LE.Angiogenesis;tumoerigenesis and the angiogenic switch[J].Nat Rev Cancer,2003,3:401-410.

[2] Folkman J.Angiogenesis in cancer,vascular,rheumatoid and other disease[J].Nat Med,1995,1:27-30.

[3] Heindell W,Schafers M,Bremer C.In vivo imaging of integrin αvβ3expression using fluorescencemediated tomography[J].Eur Nucl Med Mol Imaging,2007,34(5):745-754.

[4] 顏江華,黃志平,王生育,等.RGD-tTF水基磁流體的制備及其活性研究[J].中國生化藥物雜志,2008,29(4):229-232.

[5] 崔永剛,張春麗,王榮福,等.131I-cRGD環肽對荷黑色素瘤小鼠的靶向治療作用[J].中華核醫學雜志,2009,29:92-95.

[6] Su Zi-Fen,Jiang He,Mary Ri,et al.In vitro cell studies of technetium-99m labeled RGD-HYNIC peptide,a comparison of tricine and EDDA as coligands[J].Nuclear Medicine and Biology,2003,30(2):141-149.

[7] Zhang Xianzhong,Chen Xiaoyuan.Preparation and characterization of99Tcm(CO)3-BPy-RGD complex as αvβ3integrin receptor-targeted imaging agent[J].Applied Radiation and Isotopes,2007,65(1):70-78.

[8] Pasqualini R,Koivunen E,Kain R,et al.Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis[J].Cancer Res,2000,60(3):722-727.

[9] Wadih A,Renata P,Erkki R.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in mouse model[J].Science,1998,279(16):377-380.

[10]Sacchi A,Gasparri A,Gallo-Stampino C,et al.Synergistic antitumor activity of cisplatin,paclita-xel,and gemcitabine with tumor vasculature-targeted tumor necrosis factor-alpha[J].Clin Cancer Res,2006,12(1):175-182.

[11]Pastorino F,Brignole C,Marimpietri D,et al.Vascular damage and anti-angiogenic effects of tumor vessel-targeted liposomal chemotherapy[J].Cancer Res,2003,63(21):7 400-7 409.

[12]Meng J,Ma N,Yan Z,et al.NGR enhanced the anti-angiogenic activity of tum-5[J].The Japanese Biochemical Socity,2006,140(2):299-304.

[13]孟潔如,顏真,趙寧,等.導向性人干擾素α2a工程菌的高密度發酵[J].第四軍醫大學學報,2004,25(23):2 144-2 147.

[14]Bertilaccio MT,Grioni M,Sutherland BW,et al.Vasculaature-targeted tumor necrosis factor-alpha increases the therapeutic index of doxorubicin against prostate cancer[J].Prostate,2008,68:1 105-1 115.

[15]Fukasawa K,Fujii K,Saitoh Y,et al.Aminopeptidase N(APN/CD13)is selectively expressed in vascularendothelial cells and play a multiple roles in angiogenesis[J].Cancer Letters,2006,243:135-143.

[16]Klein SA,Hemann S,Dietrich JW,et al.Transplantation-related toxicity and acute intestinal graft-versus-host disease af ter conditioning regimens intensified with Rhenium-188 labeled anti-CD66 monoclonal anti-bodies[J].Blood,2002,99(6):2 270.

[17]尹端沚,于俊峰,汪勇先.188Re一個有希望的治療用放射性核素[J].核技術,2000,23:347-352.

[18]Schmidt PF,Suzanne L.188Re DD-3B6/22 Fab9 for use in therapy of ovarian cancer:labelling and animal studies[J].Nuclear Medicine&Biology,1998,25:639-649.

[19]Schechter NR,Yang DJ,Azhdarinia A,et al.Assessment of epidermal growth factor receptor with 99mTc-ethylenedicysteine-C225 monoclonal antibody[J].Anticancer Drugs,2003,14:49-56.

[20] Yang DJ,Azhdarinia Ali,Edmund Ki.Tumor specific imaging using Tc-99m and Ga-68 labeled radiopharmaceuticals[J].Current Medical Imaging Reviews,2005,1:25-34.

[21]余子磷,賈兵,劉昭飛,等.99Tcm標記RGD環肽四聚體在神經膠質瘤裸鼠模型中的顯像研究[J].中華核醫學雜志,2009,29:103-107.