復方腸泰體外抗大腸癌活性的有效部位篩選

許珍珍，姚 楠（江蘇省中醫藥研究院，南京市 210028）

大腸癌（Colorectal cancer，CRC）是包括從盲腸至直腸的整個腸段的癌腫，是常見的惡性腫瘤，其發病率占西方國家癌癥發病率的第二位；在中國，大腸癌的發病率近來有上升的趨勢，在惡性腫瘤中已排在第四位[1]。復方腸泰是江蘇省中西醫結合醫院腫瘤科的臨床驗方，臨床實踐中顯示出對大腸癌良好的抑制作用。多年治療數據顯示，該藥有著穩定和可靠的療效，可降低血黏度，提高患者的免疫功能，從而有效地防止大腸癌術后的復發和轉移，提高患者的生存質量。

復方腸泰是根據大腸癌的病機特點，依據健脾活血解毒法配伍而成，主要由薏苡仁、白花蛇舌草、莪術、人參、黨參、三七等藥組成。其中薏苡仁健脾利水、扶正補益為君藥，白花蛇舌草等清熱解毒、消癰散結為臣藥，莪術、三七活血化瘀、消腫止痛共為佐藥，人參、黨參補中益氣、扶正解毒為使藥。

筆者以系統溶劑萃取法提取復方腸泰的各個溶劑部位，結合體外細胞模型篩選出其抗大腸癌的有效部位，以期為復方腸泰抗大腸癌物質基礎研究提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

cell 150型CO2恒溫細胞培養箱（德國Hera公司）；classⅡtype A2型生物安全柜（美國Labconco公司）；Axio observer A型倒置相差顯微鏡（德國Zeiss公司）；Multiskan Spectrum型酶標儀（美國Thermo公司）；MH-1403型平板振蕩器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

各藥材由筆者購買并鑒定為真品；RPMI-1640培養基、DMEM培養基（美國Gibco公司）；小牛血清（民海生物工程有限公司）；MTT、胰酶（美國Amresco公司）；二甲亞砜（分析純，天津博迪化工有限公司）；氟尿嘧啶（天津金耀氨基酸有限公司）。

1.3 細胞株

人結腸癌細胞（SW480）購自中科院上海細胞所。

2 方法[2～7]

2.1 細胞的培養

按常規方法進行培養。即用含10%胎牛血清、100μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的 RPMI 1640 培養液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞換液時間為2～3 d，3～5 d傳代，傳代前以0.25%胰蛋白酶消化2～5min。取對數生長期細胞用于試驗。

2.2 溶液的提取

復方腸泰處方由人參、薏苡仁、莪術、白花蛇舌草等中藥材組成。復方腸泰濃縮液制備方法:薏苡仁、莪術用85%乙醇回流提取2次，提取液揮發去乙醇；以上藥渣與其余藥材加水煎煮2次，合并乙醇提取液和煎煮液，濃縮至含生藥2.50 g·mL-1。

將上述復方腸泰濃縮液分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取物揮去溶劑，分別得到復方腸泰石油醚部位、復方腸泰乙酸乙酯部位、復方腸泰正丁醇部位。用時分別取復方腸泰濃縮液和各部位溶解，使樣品液濃度均為含生藥1 g·mL-1。

2.3 復方腸泰各組藥物及陽性藥的加藥前處理

取復方腸泰濃縮液、復方腸泰石油醚部位、復方腸泰乙酸乙酯部位和復方腸泰正丁醇部位，加入一定量PBS，超聲30min，10000 r·min-1離心10min，取上清液，PBS稀釋，0.22 μm濾器過濾除菌，4℃貯藏，備用。陽性對照藥氟尿嘧啶用PBS稀釋為 500μg·mL-1。

2.4 復方腸泰濃縮液及各部位萃取部分對結腸癌細胞的細胞增殖抑制作用（MTT法）

取對數生長期大腸癌細胞，常規胰酶消化制成單細胞懸液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液稀釋至5×104個·mL-1，接種于 96 孔板上，每孔0.1mL。置 37 ℃、5%CO2培養箱中培養24h后，棄原培養液，加入10μL各組復方腸泰藥物與90μL RPMI 1640培養液。另設陰性對照組，加入10μL溶劑與90μL RPMI 1640培養液。每組設置6個復孔。作用48 h 后，每孔加 MTT 10μL（5mg·mL-1）繼續培養 4 h ，小心吸去上清，加入DMSO 100μL，輕輕振蕩10min后用酶標儀進行測定，測定波長為570 nm，參比波長為690 nm，重復3次。按下式計算抑制率:抑制率（%）＝（對照孔A值－給藥孔A值）/對照孔A值×100%。

3 結果

不同極性部位對結腸癌細胞SW480的增殖抑制率分別見表1、表2、表3；不同極性部位對結腸癌細胞SW480增殖抑制的比較見圖1。

表1 不同極性部位對結腸癌細胞SW480的增殖抑制率（高劑量）Tab 1 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（high-dose）

表2 不同極性部位對結腸癌細胞SW480的增殖抑制率（中劑量）Tab 2 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（medium-dose）

表3 不同極性部位對結腸癌細胞SW480的增殖抑制率（低劑量）Tab 3 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（low-dose）

圖1 不同極性部位對結腸癌細胞SW480增殖抑制的比較Fig 1 Inhibition of different polarity parts on generation of SW480 cell

由表1～表3和圖1可知，復方腸泰濃縮液對人結腸癌細胞SW480作用48 h后，2.5、5、10mg·mL-1復方腸泰濃縮液均能夠顯著抑制結腸癌細胞SW480的增殖，與陰性對照組比較，其抑制率分別為39.90%、74.37%、93.00%，呈現一定的量-效關系。進一步考察了復方腸泰濃縮液不同萃取部位的抗腫瘤活性，從抑制率看，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位抗腫瘤活性存在差異。正丁醇部位對結腸癌細胞的抑制率較高，其抑制率分別依次為34.40%、52.50%、93.83%。由此可初步確定復方腸泰抗腫瘤有效部位為正丁醇部位。

4 討論

本文通過體外試驗初步篩選出復方腸泰抗大腸癌的有效部位，并初步探索了復方腸泰中活性部位-藥效之間的關系。在后續試驗中通過研究復方腸泰正丁醇部位高、中、低劑量組對H22荷瘤小鼠瘤重、免疫器官濕重以及溶血素抗體生成的影響，來驗證其對H22荷瘤小鼠免疫功能產生的影響。結果表明，復方腸泰在抑制瘤重方面能與化療藥注射用環磷酰胺構成協同作用；在免疫方面能明顯改善環磷酰胺化療H22荷瘤小鼠所致臟器萎縮，提高胸腺和脾臟系數，增強其機體免疫功能；并且能夠升高H22荷瘤小鼠血清溶血素水平，使環磷酸胺所致的血清溶血素含量下降有明顯恢復，提高H22荷瘤小鼠的體液免疫能力。

筆者在以后的研究中，將會建立復方腸泰活性部位的指紋圖譜，探索復方腸泰中活性部位-藥效-指紋圖譜之間的關系，進一步探討其抗大腸癌的物質基礎，為創制治療大腸癌中藥新藥工作提供理論依據。

[1]Weitz，Koch M，Debus J，et al.Colorectal cancer[J].Lancet，2005，365（9454）:153.

[2]朱 凱.大腸癌中醫證治研究進展[J].實用中醫內科雜志，2008，22（10）:49.

[3]陳建平，高春芳，馬貴義.大腸癌治療進展[J].實用醫藥雜志，2008，25（2）:232.

[4]陳黎莉.大腸癌的中醫治療概況[J].實用中西醫結合臨床，2008，6（3）:93.

[5]陳 煒，肖衛東，陳祖林，等.內源性光動力療法抑制人結腸癌裸鼠種植瘤的實驗研究[J].中華實驗外科雜志，2004，21（11）:1331.

[6]羅俊卿，許其穩，王珍亮，等.氧化砷抑制結腸癌裸鼠皮下移植瘤生長及作用機制的研究[J].武警醫學，2005，16（1）:36.

[7]楊 賓，付 強，王亞娟，等.蘆薈大黃素對人結腸癌細胞SW480增殖周期及凋亡的影響[J].山西中藥，2008，24（6）:48.