雷公藤多苷對大鼠卵泡發育及其旁分泌調控機制的影響Δ

楊涓，高慧，韓冰，董江川（1.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶市 400016；.承德醫學院附屬醫院，承德市 067000；.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津市 00150；4.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶市 4011）

雷公藤多苷（GTW）是臨床應用最廣泛的雷公藤制劑，具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。部分自身免疫性疾病女性患者服藥后發生月經紊亂和閉經，故成為卵巢早衰的醫源性因素之一[1]。既往研究表明，GTW對生殖功能具有抑制作用，表現為月經周期延長、閉經、血漿雌二醇（E2）水平下降，卵泡雌激素（FSH）升高，故認為其作用靶點在卵巢[2]，而對其生殖毒理的研究則以細胞凋亡為主要研究方向[3]，未見雷公藤對卵泡發育調控因子影響的研究報道。本課題組通過對大鼠卵巢結構觀察及各級卵泡計數比較研究GTW對各發育階段卵泡的影響，并通過對旁分泌調控因子卵泡刺激素特異受體（FSHR）、表皮生長因子（EGF）和縫隙連接蛋白 43（Cx43）mRNA的表達觀察GTW對卵泡發育調控機制的影響，探討其生殖毒理機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PMr10AD型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；JEM-1010型透射電鏡儀（日本電子公司）；SYD-K2030型冷凍病理切片機（沈陽譽德電子儀器有限公司）；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（瑞士羅氏公司）；722型紫外分光光度計（上海天普分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

GTW片（湖南協力藥業有限公司，批號:20050402）；Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司，批號:15596026）；LightCycle SYBR Green I RNA一步法擴增試劑盒和LightCycle質控盒（德國Roche公司）；基因引物由寶生物（大連）有限公司合成。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，12周齡，♀，體重（260±10）g，由北京大學醫學部實驗動物部提供（動物生產許可證號:SCXK（京）2002-0001）。每日行陰道脫落細胞涂片，凡間隔4～5 d出現2次動情期者納入實驗。

2 方法

2.1 分組和給藥

將大鼠隨機分為正常（等容蒸餾水）和GTWⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ（5、10、20、50、75 mg·kg-1）組。除正常組外，其余各組ig相應GTW片水溶液，每天1次，連續28 d，第29天處死大鼠。

2.2 組織學觀察

切取的卵巢組織用4%多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋、連續5μm切片后蘇木精-伊紅（HE）染色、封片，取最大剖面切片光鏡下觀察，并計數具有正常結構的各級卵泡數、卵泡總數及黃體數。卵泡分級方法參考文獻[4，5]:小卵泡直徑＜30μm，中卵泡直徑30～600μm，大卵泡直徑＞600μm；電鏡組織經固定、沖洗、脫水、包埋、半薄切片定位后制成超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡儀觀察卵巢超微結構。

2.3 組織總RNA提取

總RNA提取:參照Trizol RNA抽提試劑盒說明書進行抽提。將卵巢組織加入液氮研磨后，加入1.5 mL trizol勻漿，加入氯仿振蕩離心，取上層水相加入異丙醇靜置離心，取沉淀加75%乙醇，振蕩離心，倒掉乙醇吹干，加無RNA酶水振蕩、離心、水浴再離心。完整性檢測:取總RNA稀釋液與Lodding buffer混合加入凝膠孔中電泳，紫外透射電鏡儀上于254 nm波長處紫外光觀察，完整的真核細胞核糖體RNA可見28、18、5 S 3條電泳帶。純度、濃度檢測:取3 μL RNA樣品稀釋10倍，于紫外分光光度計探頭上測定280/260（核酸/蛋白）、280/230（核酸/有機相）及濃度（ng·μL-1）數值。

2.4 Real-time PCR檢測

FSHR、EGF和Cx43的基因引物序列見表1。

表1 FSHR、EGF和Cx43的基因引物序列Tab 1 The gene primer sequence of FSHR，EGF and Cx43

2.4.1 反應系統 （總量20μL）Mix SYBR GreenⅠ（4μL），Resolution Solution（2 μL），MgCl2stock solution（2.4 μL），Enzyme mix（0.4 μL），Primer（上下游）（各1 μL），Total RNA（陰性對照用水）（800 ng），H2O（PCR-grade）（可變化）。反應條件:55℃ 30 min，合成cDNA；95℃ 30 s孵育，56.1℃退火10 s，72℃延伸15 s，循環40次；60℃建立融解曲線。

2.4.2 目的基因檢測 用建立的實時熒光PCR反應條件檢測目的基因的循環閾（Ct）值，依照標準曲線計算起始模板拷貝數。定量PCR儀擴增完成后自動生成熒光強度曲線，該熒光強度曲線反映所有標本不同循環時的熒光強度，陽性標本呈現典型的S型曲線，陰性對照即使擴增50個循環也為不規則的波浪線。

2.5 統計學方法

數據采用SPSS 11.5統計軟件進行分析處理。所有計量資料均以表示，兩樣本比較采用成組t檢驗。P＜0.05表示有統計學意義。

3 結果

3.1 組織形態學觀察

光鏡下觀察，正常組卵巢內可見原始卵泡、生長卵泡、成熟卵泡等各級卵泡，卵泡排列緊密，未見明顯的閉鎖卵泡，黃體數目較多，血管豐富；GTWⅠ組與正常組相當；GTWⅡ組卵巢輕度間質纖維化改變，血管減少，小卵泡明顯減少；GTWⅢ、Ⅳ、Ⅴ組卵巢間質纖維化改變明顯，血管明顯減少，各級卵泡及黃體明顯減少。HE染色結果見圖1。

圖1 HE染色結果（HE×40）A.正常組；B.GTWⅠ組；C.GTWⅡ組；D.GTWⅢ組；E.GTWⅣ組；F.GTWⅤ組Fig 1 Results of HE staining（HE×40）A.normal group；B.GTWⅠ group；C.GTWⅡgroup；D.GTWⅢgroup；E.GTWⅣgroup；F.GTWⅤgroup

電鏡下觀察，正常組卵巢內卵泡排列緊密有序，卵泡膜清晰，胞質內可見豐富的線粒體及游離核糖體，細胞核圓形，有明顯的核仁，染色質均勻；GTWⅠ組卵泡排列有序，卵泡膜清晰，顆粒細胞層豐富，結構清晰，胞質內細胞器豐富，細胞核較大，核仁明顯，核染色質欠均勻；GTWⅡ、Ⅲ組細胞排列尚有序，細胞間隙稍增寬，胞質較豐富，細胞器輕度變性，線粒體空泡變較明顯，核膜間隙增寬，核染色質欠均勻；GTWⅣ、Ⅴ組超微結構明顯受損，卵泡細胞層次紊亂，大小不一，細胞間見明顯間隙，胞質內細胞器減少且結構不清，部分細胞核呈斑塊狀凝集，細胞核異染色質凝集趨邊，核膜不清。電鏡下觀察結果見圖2。

圖2 電鏡下觀察結果（TEM×6000）A.正常組；B.GTWⅠ組；C.GTWⅡ組；D.GTWⅢ組；E.GTWⅣ組；F.GTWⅤ組Fig 2 Observation results under electric microscope（TEM×6000）A.normal group；B.GTWⅠ group；C.GTWⅡgroup；D.GTWⅢgroup；E.GTWⅣgroup；F.GTWⅤgroup

3.2 各級卵泡、黃體計數比較

GTW各組小卵泡較正常組均顯著減少，且小泡數量與用藥劑量呈負相關；GTWⅠ、Ⅱ組大卵泡較正常組無明顯減少，而GTWⅢ、Ⅳ、Ⅴ組均顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），且大泡數量與用藥劑量呈負相關；除GTWⅠ組外，其他各組黃體均顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），且黃體數量與用藥劑量呈負相關。大鼠各級卵泡和黃體計數的比較見表2。

表2 大鼠各級卵泡和黃體計數的比較Tab 2 The amounts of different levels follicles and corpus luteum in ovary

3.3 卵巢組織FSHR、EGF及Cx43 mRNA表達水平比較

GTW各組FSHR mRNA表達較正常組均無顯著性差異；GTWⅠ、Ⅱ組EGF mRNA表達較正常組無顯著性差異，其他各組均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），且表達強度與用藥劑量呈負相關；除GTWⅠ組外，其余各組Cx43 mRNA表達均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），且表達強度與用藥劑量呈負相關。卵巢組織FSHR、EGF及Cx43 mRNA表達的比較見表3。

4 討論

表3 卵巢組織FSHR、EGF及Cx43 mRNA表達的比較Tab 3 The mRNA expression level of FSHR，EGF and Cx43 in ovary

既往研究表明，GTW導致生殖抑制的靶點在卵巢[1]。卵泡是卵巢功能的物質基礎，卵泡數量及結構的改變對卵巢功能影響較大。原始卵泡數提示卵巢儲備能力，竇狀卵泡數則是對卵巢低反應性者的單一預測指標[6]。卵泡發育受卵巢血流影響，始基卵泡沒有單獨的血供，由基質血管傳遞營養物質和激素，故卵巢血流與卵巢反應密切相關[4]。因此，本研究采用卵巢組織病理學觀察結合卵泡計數比較的方法評價GTW對卵泡發育的影響。結果表明，GTW導致卵巢血管減少，組織發生纖維化改變，卵泡顆粒細胞層減少，透明帶模糊不清，提示GTW可導致卵母細胞發育環境受到損害；進一步觀察顯示卵泡細胞器減少且變性，組織呈明顯的凝集性損害，提示卵母細胞本身亦受到了GTW的影響。對各級卵泡的計數比較顯示，各劑量組小卵泡均明顯減少，提示即使低劑量GTW亦可能對卵巢儲備造成影響，而隨用藥劑量增大，則中、大卵泡數和黃體數明顯減少，提示卵泡的發育與GTW用藥劑量呈負相關。

FSH是刺激卵泡發育最重要的激素[7]，可促使竇前卵泡及竇狀卵泡的顆粒細胞（GC）增殖與分化，縫隙連接形成、分泌卵泡液，使卵泡生長發育[8]。但FSH的生理功能需通過分布于性腺的特異性受體FSHR介導，因此FSHR的表達量直接影響卵巢對FSH反應性。卵母細胞不存在FSHR，FSH對其發育的調節必須通過旁分泌途徑實現，EGF和Cx43是重要的中間環節，三者共同調節卵泡的發育。EGF可對FSH的促卵母細胞成熟作用有促進效應，而FSH能顯著增加顆粒細胞中EGF的結合點，因此認為FSH對卵泡生長的調節是通過EGF及其受體來實現的[9]。卵泡處于無血管的微環境中，縫隙連接介導卵母細胞和其周圍體細胞（顆粒細胞和卵泡膜細胞）間的代謝交換，傳遞內分泌和旁分泌的生長因子，GC通過縫隙連接持續低水平發送cAMP信號至卵母細胞，使卵母細胞滯留在減數分裂階段，并通過LH誘導信號途徑（也是一種縫隙連接）使卵母細胞最終成熟。因此，縫隙連接對于卵泡的發育以及甾類激素的分泌具有十分重要的意義。Cx43蛋白是卵巢組織表達最多的連接蛋白[10，11]。本研究表明，各GTW組FSHR mRNA表達較正常組均無顯著性差異，而EGF及Cx43 mRNA表達較正常組顯著下降，其表達量與藥物劑量呈負相關，提示GTW并非通過降低卵巢對FSH反應性來影響卵泡發育，而是通過降低EGFmRNA表達影響FSH的旁分泌途徑，并通過降低CX43mRNA表達影響卵母細胞和其周圍體細胞間的代謝交換和內分泌、旁分泌生長因子的傳遞，從而影響卵泡的發育。

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