溫敏型核雄性不育系番茄T4育性的研究

王先裕 于分弟 梁聰耀 李良劭 黃維娜 杜永臣 劉政國 曾東 潘立凡

（1廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2融安縣經濟作物推廣站，廣西 柳州 545400；3中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；4廣西壯族自治區政府，廣西 南寧 530012；5南寧市青秀區農林水利局，廣西 南寧 530213；6國家大宗蔬菜產業技術體系桂林綜合試驗站，廣西 桂林 541004）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是較早利用雜種優勢的蔬菜作物之一，一代雜種較常規品種產量提高20 %～30 %。利用雄性不育系不但減少了去雄這個繁雜的工序，而且降低了授粉難度，提高了育種效率，有效地保證了種子純度。雄性不育系已在多種作物育種中發揮了巨大的作用，因此，對不育系的尋找、探索成為研究者不斷努力的方向。

對不育機理的研究已有很多報道。對高粱（傅鴻儀，1983）、T型小麥（藤曉月和陳雪暉，1996）不育系和保持系的苗期葉片和幼穗期葉片的研究表明與育性相關的蛋白不在葉片中表達。Zhang和Chen（2001）用SDS-PAGE電泳直接檢測了莖用芥菜胞質雄性不育系花器中特異蛋白質的表達。陳蕊紅等（2009）研究推測不育系（S）-1376A雄性不育性可能與物質能量代謝、細胞程序化死亡及花發育調控等生理生化代謝有關。Sheoran等（2009）研究表明番茄細胞絨氈層的推后或提前降解都會導致雄性不育，而且在 7B-1中幾種蛋白質的表達很可能影響花粉發育。

高溫可使番茄花粉減少，而且隨著高溫時間的延長，花粉的減少量也增加，不育度也增強，尤其夜溫對不育性的影響較大（Peet & Batholomew，1996；Pressman et al.，2002）。Singh和Sawhney（1998）研究發現，低溫可使番茄 sl－2的育性恢復。陳麗等（2009）對番茄溫敏型功能型雄性不育生理機制進行研究，發現影響材料T431花柱伸長、育性轉換的最敏感時期為花芽分化期，即兩葉一心期，最敏感的溫度為18 ℃/10 ℃（晝/夜）。

本試驗主要從花粉發芽率、自交結實率、果實種子數及葉片和花藥蛋白質差異的角度，探求溫敏型雄性不育系番茄T4育性轉換的臨界溫度，同時研究影響T4表現為不育的外在表現及內在機理，為番茄育種開拓新的可利用資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為溫敏型核雄性不育系番茄T4和對照可育系First，均由日本岡山大學農學部作物繁殖研究室桝田正治教授提供。T4為原種First經γ射線輻照后所得的變異突變體，夜溫在20 ℃以上時，T4表現出穩定的雄性不育性；夜溫在20 ℃以下時，T4可恢復部分育性（Masaharu & Ojiewo，2006）。T4和對照First于 2009年8月～2010年4月種于廣西大學實驗樓人工培養箱中。

1.2 試驗方法

采用3臺人工氣候箱分別設定3個相同晝溫為28 ℃、不同夜溫（12、18、24 ℃）的處理，每天光照12 h（7：00～19：00）。幼苗3片真葉時，選擇生長狀況良好且長勢相似的3株First和9株T4，分別移入3臺人工氣候箱中，每臺氣候箱種植1株First及3株T4，水肥管理一致。至開花期，采集當天開放的花朵，取其花粉在25 ℃條件下培養2 h，調查花粉發芽率；采集生殖生長期的第2或第3片功能葉及當天開放的花，在-80 ℃下保存，用于進行蛋白質差異性分析；于果實成熟期，統計前3果穗自交結實率和果實種子數。

蛋白質提取方法：將備用的各處理番茄葉片、花藥分別稱取0.2 g和0.1 g，在冰浴條件下用樣品蛋白質提取液迅速研磨，磨成勻漿后倒入5 mL離心管中（放置冰盒中），然后于4 ℃冷凍條件下5000 r·min-1離心20 min。離心后取上層清液，分裝并貼好標簽，存于-80 ℃冰箱待用。電泳方法：Tricine-SDS-PAGE測定低分子量蛋白質法（胡天橋，2009）。電泳儀器：Power Pac HCTW電泳儀、Mini Protean 3well垂直電泳槽。

遷移率（R）=蛋白質遷移的距離/溴酚藍遷移的距離

1.3 數據處理

試驗數據采用DPS6.55軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同溫度處理對T4花粉發芽率、自交結實率及果實種子數的影響

由表1可知，28 ℃/24 ℃和28 ℃/12 ℃處理的T4花粉發芽率分別為26.9 %和30.1 %，極顯著低于對照；而28 ℃/18 ℃處理的T4花粉發芽率為54.3 %，與對照差異不顯著。表明28 ℃/18 ℃處理的T4花粉活性強，而其他兩個溫度處理的T4花粉活性弱，說明T4具有溫敏特性；夜溫為18 ℃時T4和對照的花粉發芽率最高，分別為54.3 %和63.1 %，此時T4恢復部分育性。

自交結實率除了28 ℃/18 ℃處理的T4和對照差異不顯著外，其他兩個處理T4與對照都達到極顯著差異水平，與花粉發芽率表現一致。表明高夜溫影響花粉活力，最終表現為影響自交結實率；夜溫為18 ℃的T4恢復部分育性，表現出高的自交結實率。

夜溫分別為24 ℃和12 ℃的處理T4的單果種子數都極顯著低于對照，說明T4在這兩個溫度下育性低，表現為不育，與自交結實率分析得到的結論一致，T4的最適夜溫為18 ℃。

花粉發芽率、自交結實率和果實種子數間均存在極顯著正相關關系，相關系數 r1，2=0.99、r1、3=0.94、r2、3=0.98。表明當花粉活性增高時，自交結實率提高，單果種子數也隨之增加。

表1 不同溫度處理對T4花粉發芽率、自交結實率及果實種子數的影響

2.2 Tricine-SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析

圖1 Tricine-SDS-PAGE蛋白凝膠電泳圖

由圖1和表2可知，夜溫為18 ℃的處理T4花藥中蛋白質譜帶較夜溫為24 ℃的處理少了D位點的譜帶，較夜溫為12 ℃的處理少了D、E位點的譜帶；但多了B位點的譜帶。此外，在C位點，夜溫為 18 ℃的處理 T4譜帶較其他兩個溫度處理明顯存在量上的差異。因材料遺失，缺失了對照 First的花藥譜帶。對照的葉片蛋白質譜帶沒有什么差異，僅C位點上表現出量上的稍微差異。而不同溫度處理的T4葉片蛋白質譜帶間存在差異，夜溫為18 ℃的處理較其他兩個溫度處理少了I位點的譜帶。說明不同器官蛋白質存在差異，即使在同一器官，不同的處理也會存在差異。T4在可育和不育條件下，不僅在花粉發芽率和自交結實率上存在差異，在蛋白質表達上也存在差異。

表2 差異蛋白質的相對遷移率及其蛋白質分子量

3 結論與討論

本試驗主要從夜溫不同的角度剖析番茄T4育性的臨界溫度，試驗結果表明夜溫的臨界溫度在18 ℃左右。夜溫為12 ℃與24 ℃時，T4的花粉發芽率、自交結實率及果實種子數均不存在顯著性差異，但與對照First之間存在極顯著性差異，此時T4表現為雄性不育，可用于制種。當夜溫為18 ℃時，T4的花粉發芽率、自交結實率及果實種子數與對照差異不顯著，此時T4恢復部分育性。表明番茄T4不育表現受夜溫影響，但在夜溫12 ℃和24 ℃下的T4表現出來的不育機理還有待于進一步研究。

對番茄蛋白質方面的研究尚鮮見報道，武晗等（2009）對幾種小麥雄性不育系育性敏感時期的蛋白質含量變化進行了研究，結果表明旗葉小穗發育的單核期和二核期均為育性發育的敏感時期，該時期可以檢測到特異蛋白的存在，說明該特異蛋白極有可能是與育性相關的或者育性發育所必須的。

本試驗電泳結果顯示，番茄核雄性不育系T4的葉片蛋白質和花藥蛋白質譜帶與對照都存在差異，該結論與曾維英等（2008）得到大豆雄性不育系與保持系花藥 2-DE圖譜間存在較多差異蛋白點、種子間僅有少量差異表達蛋白點、而葉片間基本上沒有差異表達蛋白點存在不同，有待于進一步驗證。

陳麗，譚麗麗，王勇.2009.番茄溫敏型功能雄性不育生理機制的初步研究.東北農業大學學報，40（1）：31-35.

陳蕊紅，葉景秀，張改生，王俊生，牛娜，馬守才，趙繼新，朱建楚.2009.小麥質核互作型雄性不育系及其保持系花藥差異蛋白質組學分析.生物化學與生物物理進展，36（4）：431-440.

傅鴻儀.1983.高粱線粒體基因組的翻譯產物與細胞質雄性不育性.遺傳學報，10（6）：471-476.

胡天橋.2009.肺結核患者血清小分子標志蛋白分離鑒定的初步研究〔碩士論文〕.廣西：廣西醫科大學.

藤曉月，陳雪暉.1996.小麥T型細胞質雄性不育系和保持系蛋白質的比較研究.作物學報，22（3）：264-270.

武晗，馬翎健，何蓓如，李薇，靳鳳，王愛芳.2009.幾類小麥雄性不育系育性敏感時期蛋白質含量的變化.西北農業學報，18（3）：94-96.

曾維英，楊守萍，喻德躍，蓋鈞鎰.2008.大豆雄性不育系與其保持系不同器官蛋白質比較.西北植物學報，28（8）：1619-1624.

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