三種方法檢測強直性脊柱炎患者HLA-B27的效果比較

趙曉君，薛 鸞，陳云飛，黃 嵐，王 靖，蔣文燕

(上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海200437)

強直性脊柱炎(AS)是一種主要侵犯脊柱，并可不同程度累及骶髂關節和周圍關節的慢性進行性炎性疾病［1］。我國AS發病率為0.3%，男女比例約4∶1，發病高峰年齡為 16～31 歲［2］。研究表明，AS與人類白細胞抗原-B27(HLA-B27)具有很強的關聯性［3］，后者已成為診斷與鑒別診斷 AS的重要依據［4］。目前臨床上檢測HLA-B27的方法有多種，比較常用的有微量淋巴細胞毒法(MLCT)、流式細胞術和序列特異性引物—聚合酶鏈式反應(PCR-SSP)法。2010年3～10月，我們分別采用上述三種方法對80例AS患者血清HLA-B27進行了測定，并對其診斷AS的敏感度、特異度等進行了比較。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期收治的80例AS患者(AS組)，男65例，女15例;年齡25～35歲，平均30.5歲。均符合1984年修訂的紐約診斷標準，臨床表現為腰椎活動受限、胸腰段或腰椎疼痛、胸廓擴張差≤2.5cm，X線表現為骶髂關節不同程度侵蝕性改變或關節間隙擴大或狹窄或部分強直等。選擇85例同期查體健康者為對照組，男68例，女17例;年齡24～42歲，平均33.2歲。兩組一般資料具有可比性。

1.2 血清HLA-B27檢測及診斷AS 的價值參數計算 兩組均抽取空腹靜脈血3 ml，分別采用下述三種方法檢測血清HLA-B27，并根據以下公式計算診斷價值參數:敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)，特異度=真陰性例數/(假陽性例數+真陰性例數)，陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)，陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)。

1.2.1 PCR-SSP法 ①模板DNA提取:采用天根DNA提取試劑盒自乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的靜脈血中提取模板DNA。②PCR反應:采用HLA-B27分型試劑盒、ABI 9700 PCR儀，每孔反應體系包括Master buffer 10 μl、DNA 2 μl、Taq 酶 0.06 μl，反應條件為96℃預變性2.5min，96℃變性15 s，65℃退火60 s，共10個循環;95℃變性15 s，62℃退火50 s，72℃延伸30 s，共22個循環。③凝膠電泳分析:配制含0.5 μg/ml溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠，將12 μl聚合酶鏈反應產物依序加到電泳膠孔中，以10 V/cm電壓強度電泳至酚紅條帶移動0.7～1.0cm。電泳完畢后將電泳膠移至Bio-Rad凝膠成像系統上攝取影像進行結果判讀。HLA-B27基因陽性者核酸片段大小為140 bp，內部對照組核酸片段大小為600 bp。

1.2.2 流式細胞術 采用美國BD公司FACS Aria流式細胞儀、HLA-B27試劑盒。反應管中加入10 μl抗 HLA-B27 FITC/CD3PE，加入 30 μl抗凝血，振蕩后室溫孵育15min，加入1∶10稀釋的溶血素1 ml，振蕩后室溫孵育10min，離心棄上清，加入2 ml PBS洗滌1次，離心棄上清，加入300 μl PBS溶液，振蕩后上機檢測。

1.2.3 MLCT法 ①分離淋巴細胞:取外周靜脈血3 ml，用淋巴細胞分離液梯度密度法分離淋巴細胞備用。②抗原抗體反應:向包被好抗體的血清板孔底加入1 μl淋巴細胞懸液、1 μl新鮮溶解的兔補體，室溫下孵育1 h，加入熒光終止劑終止反應。③結果觀察及判定:Olympus熒光倒置顯微鏡下觀察，呈紅色者為死細胞、綠色者為活細胞。每孔淋巴細胞死亡率在0～20%積2分、21%～40%積4分、41%～80%積6分、80%以上積8分，平均積分1～2分為陰性、4～8分為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS15.0軟件進行統計學處理，率的比較行χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

兩組血清HLA-B27表達情況見表1，三種檢測方法診斷AS的價值參數見表2。

表1 兩組血清HLA-B27表達情況比較(例)

表2 三種檢測方法診斷AS的價值參數(%)

3 討論

多項研究證實，血清HLA-B27陽性表達者易患AS。目前，血清HLA-B27檢測已成為臨床診斷和鑒別診斷AS的重要輔助手段，因此改進實驗條件、選擇一種有效且利于臨床診斷的檢測方法顯得尤為重要。目前常用的幾種檢測方法中，MLCT法操作簡便，不足之處為需要新鮮血至少3 ml且需足夠的活淋巴細胞;難以獲得高效價的單價血清，受細胞純度、補體差異、單抗效價及HLA高度多態性影響，易出現漏檢或假陽性;標本不能長期保存和送其他實驗室驗證等［5］。流式細胞術亦快捷簡便，不足之處為需要新鮮抗凝血、標本不能長期保存、很多基層單位無流式細胞儀等。目前對于HLA-B27的研究已經深入到等位基因水平，國內外廣泛應用的PCRSSP B27等位基因檢測技術通過設計基于人基因組中HLA-B27基因的特定核酸序列，經PCR方法擴增出特異的HLA-B27基因片段，較流式細胞術更為快速、簡便，且具有高度敏感性、特異性。

本研究顯示，三種血清HLA-B27檢測方法診斷AS的特異度均較高;PCR-SSP法、流式細胞術診斷敏感度均顯著高于MLCT，其中PCR-SSP法略高于流式細胞術。此與李慧琰［6］及黃河等［7］的研究一致。但陳建華等［8］研究表明，PCR-SSP法檢測HLAB27診斷AS的敏感度明顯高于流式細胞術。以上結論不一致的原因可能為PCR-SSP法檢測的是HLA-B27基因型，血清學技術檢測的是HLA-B27表型，而攜帶B27基因者細胞表面并不一定有B27抗原表達。本實驗中經PCR-SSP檢測為陽性，流式細胞術及MLCT測定為陰性的標本可能與某些RA患者細胞表面HLA-B27抗原不表達有關。

綜上所述，PCR-SSP法檢測 HLA-B27表達快速、簡單，且對AS診斷具有較高敏感度和特異度。

［1］Inman RD.Mechanisms of disease:infection and spondy loarthritis［J］.Nat Clin Pract Rheumatol，2006，2(3):163-169.

［2］王志瑾.現代流行病學［M］.北京:人民衛生出版社，2001:160.

［3］曹孟德，秦東春，孫含笑.HLA分子生物學及臨床應用［M］.鄭州:河南醫科大學出版社，1998:203-216.

［4］Pei R，Arjomand S，Deng CT，et al.A monospecific HLA-B27 fluorescein isothiocyanate-conjugated monoclonal antibody for rapid，simple and accurate HLA-B27 typing［J］.Tissue Antigens，1993，41(4):200-203.

［5］洪俊，張平安，李艷，等.強直性脊柱炎患者人類白細胞抗原B27三種檢測方法的對比［J］.檢驗醫學，2006，21(1):1-3.

［6］李慧琰.PCR-SSP法與微量淋巴細胞毒試驗檢測強直性脊柱炎患者 HLA-B27 的比較［J］.醫藥論壇雜志，2010，31(5):78-79.

［7］黃河，孫燕燕，眭維國，等.流式細胞術和SSP-PCR法檢測HLAB27 抗原的比較［J］.中國熱帶醫學，2007，7(9):1662-1663.

［8］陳建華，魏文寧，喻喜.PCR-SSP法與流式細胞儀檢測強直性脊柱炎患者HLA-B27的比較［J］.檢驗醫學與臨床，2007，4(3):161-162.