EV71 VP1黏膜疫苗制備及其誘導黏膜免疫的實驗研究

李志會，岳盈盈，李 鵬，宋楠楠，孟 紅

(山東省醫學科學院基礎醫學研究所，山東省罕少見病重點實驗室，濟南250062)

腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是引起嬰幼兒手足口病(HFMD)的主要病原［1，2］，目前對其感染尚無有效治療藥物及疫苗。研究表明，EV71衣殼蛋白VP1能抵抗人類胃液中胃酸破壞，為口服亞單位疫苗預防EV71感染潛在的有效抗原，對防控 EV71流行具有重要價值。2010年8月，我們通過表面展示EV71 VP1蛋白的重組枯草芽孢桿菌制備EV71 VP1黏膜疫苗，并觀察了其對小鼠體內IgA抗體的影響，旨在探討該疫苗的可行性及應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 表面展示EV71 VP1蛋白的重組枯草芽孢桿菌，VP1基因工程蛋白(本實驗室構建表達并純化)［3］，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗小鼠IgAα鏈，BALB/c小鼠，酶標板。

1.2 實驗方法 ①EV71 VP1黏膜疫苗制備:將重組枯草芽孢桿菌接種于氯霉素抗性LB培養基上，搖床37℃、250 r/min培養3 d，其后將菌液于4℃靜置2 d使芽孢充分生成，10 000 g離心5min收集菌體，用溶菌酶(20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH值為8.0，溶菌酶1 g/L)處理菌體(37℃)1 h，用PBS洗芽孢3次;另取野生型同基因株枯草芽孢桿菌做相同處理。②小鼠免疫:將32只BALB/c小鼠隨機分為觀察組和對照組各16只，分別接種上述重組枯草芽孢桿菌及野生型同基因株枯草芽孢桿菌制備的EV71 VP1疫苗，灌胃1.7×1010孢子/次 +滴鼻1.0×1010孢子/次，每周2次，共持續4周。③標本收集:取兩組免疫后小鼠以乙醚麻醉、眼動脈叢取血，收集血清于-80℃保存待用;脫臼處死小鼠，開胸將肺和心臟完整取出，自氣管斷端以1 ml PBS沖洗肺泡，離心沖洗液，收集上清，-80℃保存待用;開腹游離小腸，取出賁門端至回盲部末端全小腸，1 ml PBS沖洗小腸，離心沖洗液，收集上清，-80℃保存待用。④EV71 VP1特異性 IgA抗體檢測:采用ELISA方法檢測兩組血清、肺泡及腸組織沖洗液(肺黏膜及腸黏膜)中EV71 VP1特異性IgA抗體水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行統計學處理。計量數據以±s表示，行t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

枯草芽孢桿菌經長時間培養、4℃靜置及溶菌酶處理后均以芽孢形式存在，證實疫苗制備成功。兩組血清、肺黏膜及腸黏膜中EV71 VP1特異性IgA抗體水平見表1。

表1 兩組EV71 VP1特異性IgA抗體水平比較(n=16，±s)

表1 兩組EV71 VP1特異性IgA抗體水平比較(n=16，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01

組別 血清 肺黏膜 腸黏膜觀察組 0.407±0.056* 0.234±0.036*0.150±0.022對照組0.201±0.076 0.137±0.012 0.140±0.052

3 討論

EV71通過黏膜入侵機體而致病，故黏膜途徑疫苗對控治其感染具有重要意義。研究發現，機體存在局部和共同黏膜免疫系統，通過分泌具有高親和力中和毒素及病原微生物能力的特異IgA抗體發揮作用;口服疫苗對瘧疾、日本腦炎等非黏膜途徑感染的病原也具有良好保護作用［4］;鼻黏膜組織能初步激活局部及全身幼稚抗原特異性的CD4+及CD8+T細胞［5］。故通過適當黏膜途徑進行免疫可同時有效誘導局部黏膜免疫應答和全身系統免疫應答，且誘導局部產生黏膜相關IgA抗體的保護效應比僅誘導產生血清抗體的效果更好［4］。

芽孢用于制備疫苗的研究始于19世紀80年代。Ducle等［6］對枯草芽孢桿菌芽孢的免疫特性以及在細胞內的歸宿研究顯示，芽孢可誘導機體產生局部免疫和系統免疫反應，抗體類型主要為IgG、IgA和IgM，其中鼻腔免疫后抗體主要為IgG1、IgG2b和IgM。Mauriello等［7］用CotC為融合表達載體蛋白展示了破傷風毒素C片段(TTFC)及大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)，其黏膜免疫小鼠亦可誘導產生全身及黏膜特異性抗體;口服免疫后的小鼠可抵抗致死劑量破傷風毒素攻擊［8］。大量研究充分表明，枯草芽孢桿菌芽孢是黏膜免疫的有效載體，且芽孢表面展示抗原比芽孢萌發時展示的抗原誘導能力更加有效［9］。本研究顯示，EV71 VP1黏膜疫苗成功制備，觀察組血清及肺黏膜中VP1特異性IgA抗體水平顯著高于對照組，但兩組腸黏膜中抗體水平無顯著差異。表明該疫苗能有效刺激機體產生特異性黏膜免疫反應，但在誘導腸道黏膜免疫反應中仍有不足。可能機制:①小鼠腸道系統存在大量正常菌群，易產生免疫耐受;②鼻黏膜組織滲透性較高、酶活性低、免疫細胞眾多，刺激呼吸道黏膜免疫直接有效;③芽胞表面展示的抗原自身特性對誘導機體免疫反應具有重要作用［10］。

綜上所述，展示EV71結構蛋白VP1的枯草芽孢桿菌芽孢可成功制備疫苗，且能有效刺激機體產生特異性黏膜免疫反應;此為EV71疫苗的研制提供了新思路。

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