海南紅樹林真菌WC1018的鑒定及免疫活性研究

牛莉娜，楊 婧，汪 洋，裴 華，饒朗毓，林英姿

(海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，?？?71101)

紅樹林真菌是木本植物群落紅樹林中一個(gè)很重要的生態(tài)類別，其數(shù)量巨大，為最大的海洋真菌生態(tài)亞組［1］。海南省為兩個(gè)國內(nèi)最大的紅樹林保護(hù)區(qū)之一，分布著數(shù)量極其龐大、種類繁多的微生物［2］。2010年10月，我們從海南省文昌市清瀾港紅樹林土壤樣品中分離到一株真菌WC1018，現(xiàn)將其鑒定情況及免疫活性測定結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 自海南省文昌市清瀾港紅樹林區(qū)表層土下5～20cm土壤分離得到的菌株WC1018;海水馬丁氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中添加鏈霉素、青霉素各100 U/ml)，查氏瓊脂(CA)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基;健康成人EDTA-K2抗凝靜脈血液2 ml。

1.2 菌株WC1018的鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 ①菌落形態(tài)特征:采用固體平板培養(yǎng)法。將菌株WC1018采用點(diǎn)接種法轉(zhuǎn)接于CA平板上，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，肉眼觀察菌落直徑、菌絲顏色、菌落質(zhì)地、菌落邊緣、菌落背面培養(yǎng)基顏色、培養(yǎng)基扭曲狀態(tài)、有無滲出液產(chǎn)生及孢子大小、形狀、類型、顏色。②顯微形態(tài)特征:采用插片培養(yǎng)法［3］。將已消毒好的蓋玻片以45°角插入培養(yǎng)基中，用接種環(huán)將菌株接種于蓋玻片與培養(yǎng)基相接的沿線處，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d取片一次，采用光學(xué)顯微鏡觀察菌株顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 采用裂解法提取菌株WC1018總DNA，選用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1序列為5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和 ITS4序列為 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，分別擴(kuò)增ITS和5.8 SrDNA。反應(yīng)體積 25 μl，包括 10 × PCR buffer 2.5 μl、25 mM dNTP 3 μl、2 μM primer 2.5 μl、Template 0.5 μl、Taq DNApolymerase 2 U，dd H2O 13.6 μl。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3min;94℃變性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠，TAE為電泳緩沖液，上樣4 μl，80 V電壓電泳檢測1 h。菌株WC1024的擴(kuò)增產(chǎn)物直接送大連寶生物工程有限公司純化后測序:采用www.ebi.ac.uk生物信息網(wǎng)站上的Clustal W軟件對供試菌株序列進(jìn)行分析，鄰近—連接法聚類生成系統(tǒng)聚類樹，用Bootstrap軟件對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，并與 GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)。

1.3 菌株WC1018免疫活性測定 采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔中加入人外周血單個(gè)核細(xì)胞1×105個(gè)，在待測樣本孔中加入經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液10-2稀釋的過濾后菌株WC1018發(fā)酵上清液，陽性對照孔內(nèi)加入含5mg/ml植物血凝素(PHA)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 ml，陰性對照孔內(nèi)加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 ml，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，加入含5mg/ml的MTT基礎(chǔ)培養(yǎng)液20 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)。4 h后棄培養(yǎng)上清，每孔中加入100 ml DMSO，振蕩器震搖10min，酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長測定細(xì)胞增殖活性(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，行單因素方差(One-way ANOVA)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 菌株WC1018鑒定情況

2.1.1 菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征 根據(jù)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征該菌株初步鑒定為曲霉屬(Aspergillus)。①菌落形態(tài)特征:菌株在28℃下于CA上生長旺盛，3 d左右可見菌落生長，初為扁平、墨綠色菌落，生長速度快，7、14 d菌落直徑分別約19、36 mm。菌落不平，較厚，質(zhì)地絲絨狀，中央凹陷、黃褐色，呈輻射環(huán)向外生長，近邊緣呈墨綠色，外緣呈白色絨狀突起，背面顏色為黃褐色，無氣味。培養(yǎng)12 d后有少量紫紅色滲出液產(chǎn)生。37℃不生長。②顯微形態(tài)特征:菌絲無色，有橫隔;分生孢子頭呈疏松輻射狀，大小為100～120 μm。分生孢子梗光滑無色，無橫隔，直徑8～12 μm;孢子梗頂端膨大形成半球形的頂囊，上半部著生雙層小梗，?；?.5～7 μm×2～3 μm，小梗 5～7 μm ×2～2.5 μm，分生孢子球形，粗糙，直徑2.5～3 μm。

2.1.2 分子生物學(xué)特征 測序獲得菌株WC1018 5.8SrDNA及ITS序列長度為545 bp。Neighbour-Joining構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上與菌株WC1018同源性較高的序列均為曲霉屬，其中與雜色曲霉(Aspergillus versicolor)菌株LTBF 011-1的5.8SrDNA及ITS序列同源性最高，相似率及Bootstrap支持率均為100%。

2.2 菌株WC1018免疫活性 菌株WC1018與對照菌株處理后細(xì)胞增殖活性見表1。

表1 菌株WC1018與對照菌株處理后細(xì)胞增殖活性比較(OD 值，±s)

表1 菌株WC1018與對照菌株處理后細(xì)胞增殖活性比較(OD 值，±s)

注:與陰性對照比較，*P＜0.05

菌株 第1次 第2次 第3次WC1018 0.437±0.028* 0.458±0.013* 0.465±0.031*陽性對照 0.423±0.022* 0.462±0.037* 0.476±0.028*陰性對照0.261±0.031 0.273±0.020 0.259±0.041

3 討論

目前，絕大多數(shù)海洋真菌代謝產(chǎn)物來自子囊菌及其無性型菌。常見的產(chǎn)生新型次生代謝物的真菌為曲霉屬、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、擬青霉屬(Paecilomyces)等。高昊等從海南文昌紅樹林分離到一株泡盛曲霉，發(fā)現(xiàn)其具有合成細(xì)胞毒活性及新型多羥基甾醇脂肪酸酯結(jié)構(gòu)化合物的能力［4］;崔海濱等從海南文昌紅樹林篩選到一株真菌，從其發(fā)酵液提取物中分離到兩種抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的化合物［5］。由于真菌的表型特征較為復(fù)雜，僅使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察方法往往很難將一個(gè)菌株準(zhǔn)確鑒定到種，也很難弄清其與近緣種之間的生物系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。近年來，利用5.8SrDNA及ITS序列分析進(jìn)行真核生物系統(tǒng)發(fā)育、分類鑒定和多樣性研究已經(jīng)成為有效而快速的方法［6～8］。

本研究顯示，WC1018的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征與曲霉屬相似;Neighbour-Joining構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上與菌株WC1018同源性較高的序列均為曲霉屬，其中與雜色曲霉菌株LTBF 011-1的5.8SrDNA及ITS序列同源性最高，相似率及Bootstrap支持率均為100%。故根據(jù)中國真菌志(第一版)第5卷曲霉屬及其相關(guān)有性型的分類觀點(diǎn)，菌株WC1018歸屬于半知菌亞門，絲孢菌綱，絲孢菌目，叢梗孢科，曲霉屬，巢狀亞屬雜色組，雜色曲霉;與海南文昌紅樹林土壤中真菌優(yōu)勢類群及海洋真菌產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)物質(zhì)的優(yōu)勢菌均一致［9］。有關(guān)雜色曲霉的免疫增強(qiáng)作用罕見報(bào)道。本研究顯示，WC1018發(fā)酵液處理后細(xì)胞增殖活性顯著強(qiáng)于陰性對照。提示菌株WC1018可能有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效果。

綜上所述，自海南省文昌市清瀾港紅樹林土壤樣品中分離到的菌株WC1018為具有顯著免疫增強(qiáng)活性的雜色曲霉。

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