RNA干擾沉默Cyclin D1基因?qū)σ认侔〢sPC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響

肖衛(wèi)東，李 勇，李學(xué)明，蔡 軍，鄧 君，曾林山，胡 偉

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006)

近年研究顯示，細(xì)胞周期失控與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而調(diào)控細(xì)胞周期諸多因素的核心是細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)。Cyclin D1為G1期細(xì)胞周期素，在許多惡性腫瘤組織中均有異常表達(dá)，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。2009年1月～2010年12月，我們觀察了RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默Cyclin D1基因表達(dá)對胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株(上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫)，pSilencer2.1-U6-neo質(zhì)粒，Cyclin D1-小干擾 RNA(siRNA)和陰性對照 siRNA質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室前期研究制備，并經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定和DNA測序分析證實(shí));T4 DNA連接酶，抗人 Cyclin D1單克隆抗體，感受態(tài)大腸桿菌DH5α，碘化丙啶(PI)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，DMEM 培養(yǎng)基，Trizol RNA分離試劑和 LipofectamineTM2000，SYBR ? Green PCR Core Reagents。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染AsPC-1細(xì)胞 用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)AsPC-1細(xì)胞，至對數(shù)生長期后以2×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染Cyclin D1-siRNA、陰性對照siRNA、脂質(zhì)體，siRNA終濃度為40 nM，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染6 h后更換成DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，48 h時(shí)收集細(xì)胞。

1.3 AsPC-1細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)檢測 采用熒光定量RT-PCR法。PCR引物采用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)，上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。Trizol法提取1.2各組樣本細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR?Green PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系為25 μl，其中含 10 × Buffer、MgCl2、dNTP 混合物(10 mmol/L)、Taq酶、UNG 酶、引物(目的基因/內(nèi)參/空白)、cDNA模板、DEPC-H2O，于RT-PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為50℃孵育2min，95℃ 10min，95℃變性15 s，52℃退火延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。由PCR反應(yīng)曲線得到域值循環(huán)數(shù)(Ct)，以 GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算 Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量(RQ 值)=2-ΔΔCt。

1.4 AsPC-1細(xì)胞 Cyclin D1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。收集1.2各組細(xì)胞，蛋白提取液提取蛋白，Bradford法測蛋白含量。每泳道25 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)NC膜，鼠抗人Cyclin D1(1∶200)過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育 1 h，DAB 顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝影。以β-actin作為參照。Quantity One軟件分析Cyclin D1與β-actin條帶的灰度比值(%)，即Cyclin D1蛋白相對表達(dá)量。

1.5 AsPC-1細(xì)胞體外增殖活力檢測 采用MTT法。取1.2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h前按每孔5×103個(gè)細(xì)胞傳代至96孔培養(yǎng)板，其后按上述分組及方法轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)12、24、48、72 h后每孔加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT 30 μl，37℃作用4 h，用PBS洗2次后每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15min使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀測定570 nm波長下的吸光度值(OD值)。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 AsPC-1細(xì)胞周期及凋亡率(AI)檢測 采用流式細(xì)胞儀法。轉(zhuǎn)染48 h后收集1.2各組106個(gè)細(xì)胞，離心，冷PBS清洗細(xì)胞2遍，將細(xì)胞用1 ml注射器快速推入70%冷乙醇中，4℃固定12 h以上。PBS洗2遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，用 RNase消化后PI染色，混勻后流式細(xì)胞儀進(jìn)行單參數(shù)分析，用累積曲線分割法計(jì)算各期細(xì)胞所占比例。G1峰前面出現(xiàn)的亞2倍體峰即為凋亡峰，用吖啶橙染色凋亡細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩個(gè)樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 AsPC-1細(xì)胞Cyclin D1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量 ①Cyclin D1 mRNA:實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.27±0.03、0.99±0.08、1.00±0.11，實(shí)驗(yàn)組顯著低于空白對照組和陰性對照組(P均＜0.01)，而兩組比較無明顯差異;與空白對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1 mRNA抑制率為73.6%。②Cyclin D1蛋白:實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組Cyclin D1蛋白相對表達(dá)量分別為(13.0±2.6)%、(75.5±6.8)%、(73.6±6.2)%，實(shí)驗(yàn)組顯著低于空白對照組和陰性對照組(P均＜0.01)，兩組比較無明顯差異;與空白對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1蛋白抑制率為82.3%。

2.2 AsPC-1細(xì)胞體外增殖情況 轉(zhuǎn)染后24～72 h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長速度較空白對照組和陰性對照組明顯減慢(P均＜0.01)，后兩組細(xì)胞生長無明顯差異，見圖1。

圖1 三組AsPC-1細(xì)胞生長曲線

2.3 AsPC-1細(xì)胞周期分布和AI 三組AsPC-1細(xì)胞周期分布和AI見表1。

表1 三組 AsPC-1細(xì)胞周期分布及AI(±s，%)

表1 三組 AsPC-1細(xì)胞周期分布及AI(±s，%)

注:與其他兩組比較，*P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M AI實(shí)驗(yàn)組 93.46±4.17* 2.64±0.62* 3.90±1.83* 25.4±1.82*陰性對照組 50.88±1.26 35.22±0.84△ 13.90±0.36 4.2±0.64空白對照組45.23±1.87 38.15±1.33 16.62±0.51 2.9±0.33

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的Cyclin有A、B1及B2、C、D1～D3、E、F、G、H 等十余種，其中 Cyclin D1與G1期關(guān)系最為密切。正常情況下，Cyclin D1蛋白僅在G1早期呈一過性表達(dá)，半衰期約20min，其與細(xì)胞周期素依賴激酶-4/6(CDK4/CDK6)結(jié)合形成的復(fù)合物可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖［1，2］;Cyclin D1 表達(dá)異常可導(dǎo)致細(xì)胞增殖周期失調(diào)，DNA提前復(fù)制，促使細(xì)胞發(fā)生癌變。文獻(xiàn)報(bào)道［3～6］，在胰腺癌組織中 Cyclin D1蛋白的表達(dá)率為62.3%～72%、Cyclin D1 mRNA表達(dá)率高達(dá)82%，而正常胰腺組織中幾乎未見陽性表達(dá)，且Cyclin D1過度表達(dá)與胰腺癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此，Cyclin D1可作為胰腺癌基因治療的潛在靶點(diǎn)之一。

RNAi是應(yīng)用雙鏈RNA分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)使其沉默的過程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。RNAi作為一種簡單、快速關(guān)閉特定基因功能的技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)基因治療的有力工具之一。蔣磊等［7］報(bào)道轉(zhuǎn)染siRNA-Cyclin D1可有效抑制乳腺癌MCF細(xì)胞株中Cyclin D1表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。在對白血病 K562細(xì)胞［8］、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞［9］和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29［10］等的研究中也有類似報(bào)道。本研究顯示，實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著低于其余兩組。表明本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)合成的針對Cyclin D1基因靶序列的siRNA能有效沉默目的基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還顯示，與其他兩組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長速度明顯減緩，S期細(xì)胞比例明顯下降，G0/G1細(xì)胞比例明顯增加，AI顯著上升;空白對照組和陰性對照組細(xì)胞周期及AI無顯著差異。提示靶向沉默Cyclin D1基因表達(dá)可顯著改變細(xì)胞周期分布、促進(jìn)細(xì)胞凋亡;陰性對照質(zhì)粒對Cyclin D1基因表達(dá)、AsPC-1細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡并無明顯影響。

綜上所述，Cyclin D1-siRNA能通過沉默靶基因表達(dá)抑制AsPC-1細(xì)胞生長、改變細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可作為胰腺癌基因治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。

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