湖北省煙草黑脛病菌生理小種研究初報

李錫坤，孔凡玉，李錫宏，王 靜，張成省，馮 超，陳雅瓊，劉 璇，蘇振剛，李佰樂

(1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081；3.湖北省煙草研究所，武漢 430000；4.云南省玉溪市煙草公司，云南 玉溪 653100)

煙草黑脛病于 1896年在印度尼西亞的爪哇首次發現，此后迅速蔓延全世界，成為煙草生產上最具毀滅性的病害之一[1]。煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）可以為害所有栽培煙草，主要侵染煙草根部和莖基部，高溫、高濕有利于病原的侵染，隨著病害的發展，煙株根系和莖基部變黑腐爛，最終導致煙株死亡。20世紀60年代以來，美國、南非、印度、中國等主要產煙國對其致病性與生理分化進行了研究[2]。迄今為止，國內外已發現0號、1號、2號、3號共4個煙草黑脛病生理小種。朱賢朝等[3-8]在20世紀80年代對我國煙草黑脛病菌生理小種的研究發現，我國存在 0號和1號生理小種及一個未鑒定出生理小種的致病型。李錫宏等[9]于1995—1998年從湖北恩施州煙草上采集到黑脛病標樣102個，分離純化出46個菌系，用游動孢子懸浮液注射 10葉期左右鑒別寄主的莖基部，所用鑒別寄主為L8（具有N.longiflora抗性）、NC1071（具有N.Plumbaginifolia抗性）、N.nudicaulis和小黃金1025。結果表明，46個菌系對L8、NC1071和N.nudicaulis無致病力，為0號小種。本研究對 2009年采集的湖北煙草黑脛病菌進行了生理小種的初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與病原分離

1.1.1 樣品采集 自2009年7—9月，于湖北省主產煙區采集具有典型癥狀的煙草黑脛病標樣 111個，分離純化得到煙草黑脛病病原菌樣本 30個。其中，烤煙標樣22個，白肋煙標樣7個，曬煙標樣1個。

1.1.2 病原分離 取典型的煙草黑脛病病株，用自來水洗凈莖稈，將枝葉及根系等去除，在超凈工作臺內用75%酒精擦拭莖稈后燒去殘余酒精，用滅菌解剖刀將莖稈縱向剖開，用滅菌鑷子夾取髓部碟片或滅菌解剖針挑取髓部碟片間菌絲放入選擇性燕麥培養基平板上，每皿均勻放置3～4塊，28 ℃溫箱中培養，2～4 d后挑取邊緣菌落純化。

1.2 培養基的制備

燕麥培養基配方[10]：燕麥片30 g，瓊膠17～20 g，水1 L。

選擇性燕麥培養基[11]：在燕麥培養基倒平板前（約冷卻到40 ℃）加入100 mg/L利福平、50 mg/L氨卞青霉素、50 mg/L五氯硝基苯和50 mg/L制霉菌素。

TTZ培養基[12]：TTZ液體培養基的基本成分為蔗糖30 g、檸檬酸20 g、氯化鈣1.0 g、硝酸鉀2.0 g、磷酸二氫鉀0.67 g、磷酸氫二鉀0.33 g、1%氯化鐵溶液10滴、VB11 mg和蒸餾水1 L。將上述各試劑在燒杯內混勻溶解后，調節pH至5.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后加入經細菌過濾器滅菌的0.05%（W/V）TTZ（2,3,5-氯化三苯基四氮唑，2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride）。

TTZ固體培養基為燕麥培養基在倒平板前（冷卻至約 40 ℃）加入經細菌過濾器滅菌的 0.05%(W/V)TTZ[13]。

1.3 TTZ顏色反應鑒定

1.3.1 TTZ液體培養基中的顏色反應 供試煙草的黑脛病菌在28 ℃培養箱內培養3～5 d，用直徑為 5 mm的打孔器取邊緣菌齡一致的菌塊，移入TTZ液體培養基中，以不加TTZ的液體培養基為對照，處理和對照皆設3個重復。置于28 ℃培養箱，接種后72 h分別觀察培養基及菌體的顏色變化。

1.3.2 TTZ固體培養基中的顏色反應 供試煙草的黑脛病菌在28 ℃培養箱內培養3～5 d，用直徑為 5 mm的打孔器取邊緣菌齡一致的菌塊，移入TTZ固體培養基中，以不加TTZ的燕麥瓊脂培養基為對照，每個處理和對照皆設3個重復。置于28 ℃培養箱，接種24 h后分別觀察培養基及菌體的顏色反應。

判斷依據[12]：0號和1號生理小種在TTZ液體培養基中，72 h內菌絲全部變為紅色；在固體培養基中，24 h菌體變為紅色；3號生理小種在TTZ液體培養基和固體培養基中均不變紅。

1.4 鑒別寄主鑒定

1.4.1 鑒別寄主 選擇反應相對穩定的煙草品種NC1071、L8、N.nesophila、Florida301作抗病對照，小黃金1025作感病對照。0、1、2和3號生理小種在選定的鑒別寄主上的反應見表1[14]。

表1 煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應Table1 The response of Phytophthora nicotianae on the different hosts

1.4.2 育苗 煙草種子于 25 ℃下用滅菌水黑暗浸泡約3～5 d，播于裝有高壓滅菌濕潤土的盤中，置于24～28 ℃溫室培養，幼苗3片真葉時移栽于裝有滅菌砂壤土的塑料盆缽中（直徑12 cm）。

1.4.3 游動孢子懸浮液的制備 向培養14～21 d的供試菌株培養基平板內，加入 0.1%KNO3和 1%葡萄糖溶液，黑暗浸泡2 d，之后4 ℃處理40 min，25 ℃靜置20 min，調整游動孢子濃度為1×104個/mL。

1.4.4 接種方法 用醫用注射器（5號針頭）吸取制備好的游動孢子懸浮液，選取6～8葉期煙苗，莖基部注射菌液，置于25～28 ℃溫室，維持濕度90%，誘發病害。每處理4次重復，重復2株。每7 d調查病情，連續調查3次。

1.4.5 煙草黑脛病分級標準 0級：全株無病。

1級：莖部病斑不超過莖圍的1/2，或（和）半數以下葉片或頂葉輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑。

2級：莖部病斑超過莖圍的1/2，或（和）半數以上或部分腰葉以上葉片凋萎。

3級：莖部病斑環繞莖圍，或（和）2/3以上葉片或下一棚以上葉片凋萎。

4級：病株枯死。

2 結 果

30個菌株在TTZ固體培養基上接種24 h即可見接入的菌塊變為紅色，并且隨著培養時間的加長，紅色范圍逐漸擴大，從培養基平板背面觀察，呈紅色圓斑（圖1）。30個菌株在TTZ液體培養基培養72 h后，其菌體變為淺紅，并且液體培養基亦呈淺紅色（圖2）。根據反應[12]，排除供試菌株為3號生理小種的可能，即供試菌株為煙草黑脛病菌的0號或1號生理小種。

圖1 煙草黑脛病菌在TTZ固體培養基中的變色反應Fig.1 The mycelial color of Phytophthora nicotianae on solid TTZ medium cultured after 24 h

圖2 煙草黑脛病菌在TTZ液體培養基中的變色反應Fig.2 The mycelial color of Phytophthora nicotianae on liquid TTZ medium cultured after 72 h

由表2可看出，全部供試菌株在N.nesophila、Florida301和小黃金1025品種上的反應分別表現為抗病、中抗和感病，但在NC1071和L8品種上的反應表現有差異。其中，24個菌株在 NC1071和L8品種上的反應皆表現為感病，病情指數分別為78.13～100和75.00～100。依據煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應（表1）與TTZ顏色反應結果，初步鑒定24個菌株為1號生理小種，其余6個菌株在NC1071和L8品種上的反應有所不同：BD-1菌株在2個品種上均為抗病，Xf-1、LC-2、XF-4三個菌株中感 NC1071中抗 L8，LC-5菌株中抗 NC1071感L8，ES-5菌株感NC1071中抗L8。根據TTZ顏色反應結果，排除6個菌株為3號生理小種的可能，是否為2號生理小種還是其他致病型，尚待進一步研究確定。不同菌株在鑒別寄主上的反應如圖3。

3 討 論

供試的30個菌株在TTZ液體和固體培養基中的反應皆為紅色。與TTZ液體培養基相比，在TTZ固體培養基中顏色變化更為明顯。不管是液體培養基中的菌絲，還是固體培養基中的菌絲，變色部分菌體菌絲的原生質皆呈現紅色。John L McIntyre和G S Taylor[14]認為菌體在TTZ培養中變為紅色是與菌絲體中新陳代謝活躍的細胞中的脫氫酶有關。而王智發等[12]認為，煙草黑脛病菌0號、1號生理小種可以使 TTZ培養基變色的基本機制是脫氫酶與TTZ發生氧化還原反應生成了紅色物質，且越是具有活性的菌體，變色愈深。由此說明，0號和1號生理小種的菌體內存在與 TTZ發生氧化還原反應的脫氫酶，而3號生理小種不具有可以與TTZ發生氧化還原反應的脫氫酶。TTZ與脫氫酶作用的具體機制仍有待進一步的研究[12,15]。與生理小種間某些培養性狀差異和其他生理生化特性相比，TTZ顏色反應有著較小的誤差和較明顯的可辨認性，在煙草黑脛病菌生理小種的鑒定上起到了良好的輔助作用。

表2 煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應及生理小種類型Table2 The response of Phytophthora nicotianae on the different hosts

圖3 煙草黑脛病菌株在各寄主上的反應Fig.3 The response of several strains of Phytophthora nicotianae on the different hosts

國內外鑒別煙草黑脛病菌生理小種的寄主有很多，常用的有Florida301, L8, NC1071, Nicotiana.plunbaginifolia, Nicotiana.nesophila, Nicotiana.stocktonii, Nicotiana.nudicaulis, Burley21, Burley37,（L8×Burley21）F1等。有研究資料證明抗性來自N.longiflora的L8和抗性來自N.Plumbaginifolia的NC1071的抗性基因片斷是相似的，且都為顯性單基因遺傳，根、莖的抗性與正株抗性高度相關，且對0和1號生理小種的抗感反應是穩定的，因此不僅把這兩個材料作為田間出現 1號小種的指示寄主，同時也是區分0號和1號生理小種的標準鑒別寄主，而把莖接種技術作為標準接種方法[3]。N.nesophila對煙草黑脛病0號和1號生理小種的反應是抗1號感0號生理小種，且它是野生種，基因比較穩定，自然變異的可能性較小[8,13]。因此，本次試驗選用NC1071、L8和N.nesophila作為區分0號和1號小種的鑒別寄主，小黃金1025作感病品種對照。

迄今為止，國內外已報道的煙草黑脛病菌有 4個生理小種。1962年，Apple[16]在美國北卡羅萊納州發現了0號和1號生理小種，現0號和1號生理小種廣泛發生于世界煙草種植區；1973年Pringsloo G C等[17]在南非鑒定出煙草黑脛病菌 2號小種；1978年John L Mclntyre等[14]在美國康涅狄格州鑒定出3號小種。國內報道的煙草黑脛病菌生理小種是0號和1號。朱賢朝等[6]于20世紀80年代研究發現，認為我國主要煙區的煙草黑脛病菌，0號生理小種是優勢種，亦有1號生理小種和1個致病型。其中，湖北省有1個菌系為1號生理小種，2個菌系為0號生理小種。1999年，李錫宏等[9]對湖北省恩施州煙草上分離得到的 46個菌系進行生理小種鑒定，認為46個菌系是0號生理小種，恩施煙區煙草黑脛病菌以0號生理小種占主導地位。

根據本研究，供試24個菌株為煙草黑脛病菌1號生理小種，占供試菌系的80%，與李錫宏等[9]1999年鑒定湖北恩施州煙草黑脛病菌基本是0號生理小種的結果發生了較大變化，是受品種基因型的影響，還是環境與遺傳基因共同作用的結果，還待進一步研究探討。

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