煙草基因組學(xué)研究方法篇：3.煙草功能基因組學(xué)中的功能缺失與功能獲得策略

李鳳霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

功能基因組學(xué)研究中，常常通過改變基因的表達水平，然后觀察其生物學(xué)性狀、環(huán)境適應(yīng)性以及生理或代謝途徑等方面的變化來研究基因相應(yīng)的生物學(xué)功能。這種研究策略包括強制性地沉默或升高特定基因的表達水平，即功能缺失（loss of function）和功能獲得（gain of function）策略。

1 功能缺失策略

基因功能缺失策略即篩選目的基因功能部分或全部喪失的植株，比較其與野生型植株在表型、生理代謝和基因表達上的差異，分析該基因的功能。以往功能缺失研究通常是通過篩選自然突變體來獲得基因功能部分或全部喪失的植株，但概率很低，現(xiàn)在一般通過反義RNA（antisense RNA）、共抑制（cosuppression）、人工誘變、RNA干擾（RNA interference, RNAi）來進行基因功能缺失研究。

1.1 反義RNA

反義RNA是指與特定DNA或RNA具有互補序列的小分子RNA，它們通過特異性的堿基互補方式抑制或封閉相應(yīng)基因的表達。反義RNA技術(shù)提供了直接有效地人為控制基因表達的方法，現(xiàn)已成為功能缺失研究中的一項重要技術(shù)[1]，并在煙草功能缺失研究中得到較多的應(yīng)用[2-3]。由于該方法的抑制效率不能達到理想的功能缺失，因而無法對基因功能進行大規(guī)模的準(zhǔn)確分析，使得其應(yīng)用受到一定的限制。

1.2 共抑制

共抑制是指正向的基因全長序列與高活性的組成型啟動子或組織特異性啟動子融合，進行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株中該序列所表達的RNA抑制了相應(yīng)內(nèi)源基因的表達。共抑制現(xiàn)象來源于一些植物轉(zhuǎn)基因事件偶然發(fā)現(xiàn)，最著名的是Napoli等[4]的矮牽牛花色改良實驗，將花色有關(guān)的查爾酮合成酶基因（CHS）在矮牽牛中過表達后，約50%轉(zhuǎn)基因植株的外源CHS與內(nèi)源基因一起發(fā)生沉默，導(dǎo)致花色改變。Matzke等[5]將Hyg OCS轉(zhuǎn)化經(jīng)過KanNOS基因遺傳轉(zhuǎn)化的煙草中，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因的基因失活現(xiàn)象。Goring等[6]進行了相似的實驗，將nopaline合成酶基因的部分編碼序列轉(zhuǎn)化到已經(jīng)轉(zhuǎn)化了nopaline合成酶基因并能表達的轉(zhuǎn)基因煙草中，該基因的mRNA降到了最低點。

1.3 人工誘變方法

人工誘變獲得突變體是功能缺失研究中不可缺少的一種方法，突變能導(dǎo)致基因功能的喪失或減弱。其中在T-DNA插入突變研究中，根據(jù)目標(biāo)基因序列和插入序列設(shè)計的特異引物對這些突變體基因組DNA進行PCR擴增，可以篩選到任何一個插入失活的基因。目前在煙草上通過人工誘變的方式獲得了抗煙草花葉病、不育、溫度依賴、低煙堿、白化等突變體，并鑒定了部分導(dǎo)致功能缺失的突變基因[7]。由于煙草是異源四倍體植物，煙草中有有一定數(shù)量的基因是多拷貝的，甚至緊密地串聯(lián)在一起，在利用人工誘變方法分析基因功能時，通常不易得到目標(biāo)基因的純合突變體。

1.4 RNAi

RNAi是指雙鏈RNA分子引起的序列特異性降解靶基因mRNA，從而導(dǎo)致內(nèi)源靶基因沉默的現(xiàn)象。與反義RNA和共抑制技術(shù)相比，RNAi能夠強有力地抑制序列特異的目的基因表達，抑制效率高，操作簡便、迅速，耗費的精力和財力較小。現(xiàn)在，RNAi技術(shù)已經(jīng)成為基因功能缺失研究的常規(guī)手段，并成為當(dāng)前植物生物學(xué)家探索基因功能的一個有力的工具[8]，在煙草基因缺失研究中也具有良好的應(yīng)用前景[9]，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所通過GATEWAY方法構(gòu)建煙草抗病基因同源序列的RNAi文庫，通量遺傳轉(zhuǎn)化后進行相應(yīng)基因的功能鑒定。

2 功能獲得策略

新基因的功能獲得策略是指通過將新基因直接導(dǎo)入到細胞或生物體中，通過觀察其細胞生物特性或特體表型遺傳性狀的變化來鑒定基因的功能，常用的方法有超表達（overexpression）、基因誘導(dǎo)表達（inducible gene expression）和獲得性突變。

2.1 超表達

超表達是指目的基因全長序列與高活性的組成型啟動子或組織特異性啟動子融合，通過轉(zhuǎn)化，獲得該基因產(chǎn)物大量積累的植株。該方法已成功鑒定了一批煙草編碼基因、轉(zhuǎn)錄因子的功能[10-11]，但與反義抑制和共抑制類似，它也有轉(zhuǎn)基因植株的致死效應(yīng)或強烈的多重效應(yīng)，從表型中鑒定出所需的轉(zhuǎn)基因植株較為困難。

2.2 基因誘導(dǎo)表達

在轉(zhuǎn)基因的突變體、異源受體植株或組織中，通過在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動子或誘導(dǎo)表達啟動子，控制外源基因在特定的時間或特定的組織器官中表達，可避免超表達所帶來的麻煩。在非誘導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)基因不表達或表達但其產(chǎn)物沒有活性，不會干擾植物的正常發(fā)育，也不會導(dǎo)致多重效應(yīng)。一旦給予誘導(dǎo)，基因?qū)⒀杆俦磉_或其產(chǎn)物迅速被激活，并在一定時間內(nèi)保持穩(wěn)定。利用誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因被誘導(dǎo)表達，從表型變化鑒定了其功能[12]。

2.3 獲得性突變

功能獲得性突變方法是從本質(zhì)上改變基因作用的一種突變，該方法能使在植物特定組織、細胞中原來不表達的基因得以表達，或表達較弱的基因表達水平升高，使表型更加明顯。常用的功能獲得性突變策略是對T-DNA進行人工修飾，在T-DNA上加入調(diào)控序列，如35S強啟動子或其他特異性表達啟動子，插入的T-DNA可能導(dǎo)致插入位點鄰近基因的過量表達或表達的時空特異性改變，從而有效的鑒定基因功能。

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