天芪降糖膠囊對糖耐量受損患者嘌呤嘧啶代謝的干預作用

鐘宏福， 梁瓊麟， 胡 坪， 夏建飛， 仝小林， 王義明， 羅國安*

(1.華東理工大學藥學院，上海 200237;2.清華大學中藥現代化研究中心，北京 100084;3.華東理工大學化學與分子工程學院，上海200237;4.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

糖尿病前期是進展性部分代謝綜合癥的一種，主要是由糖代謝異常導致空腹或者糖耐量血糖過高，但未達到糖尿病診斷標準，分為空腹血糖受損(IFG)和糖耐量受損(IGT)，兩者均是發展成糖尿病和心血管類疾病的危險性因素。IGT作為正常糖耐量和糖尿病之間的一種中間狀態，在臨床上可通過糖耐量測試來鑒定。根據世界衛生組織1999年的標準，空腹血糖 ＜7.0 mmol/L且口服75 g葡萄糖2 h后血糖≥7.8 mmol/L＜11.0 mmol/L被認為是糖耐量受損。據最新調查結果顯示，目前我國糖尿病前期的發病率為15.5%(男性占16.1%，女性占14.9%)，而其中 IGT發病率約為 IFG的3.5倍［1］。因此，對糖尿病前期IGT的治療和研究越來越受到重視。

對糖尿病前期IGT的干預主要包括生活方式和藥物干預，研究證實兩者均能取得良好的效果［2］。然而，對部分由于個人因素導致不適合生活方式干預或效果不明顯患者藥物治療則顯得尤為重要。天芪降糖膠囊是在中醫理論指導下，經過長期的臨床實驗研究與對比得到的有效經驗方，主要由黃芪、天花粉、女貞子、石斛、生曬參、地骨皮、墨旱蓮、五倍子、山茱萸、黃連等中藥配伍而成。在臨床上主要用于糖尿病前期IGT和糖尿病各個階段的治療作用。

研究表明，糖尿病前期IGT患者血糖、胰島素抵抗、尿酸水平之間存在顯著的相關性(P＜0.001)［3－4］。尿酸是嘌呤代謝的終產物而嘌呤嘧啶是組成DNA和RNA的基本成分。因此，嘌呤嘧啶代謝循環可能與糖尿病的發生發展存在著一定的相關性。在本實驗室前期對糖尿病及糖尿病腎病的研究中，我們發現了5種與糖尿病及其發展相關的嘌呤嘧啶類潛在生物標志物(尿酸、肌酐、黃嘌呤、肌苷、腺苷)［5－7］。本研究以嘌呤嘧啶代謝循環為基礎，以血糖和尿酸、肌酐、肌苷、肌酸、黃嘌呤、次黃嘌呤、胸苷、尿苷、腺苷等9種代謝物(含上述5種潛在生物標志物)濃度的變化作為研究對象來考察天芪降糖膠囊對IGT患者嘌呤嘧啶代謝循環的干預作用。

1 實驗材料

1.1 樣本與試劑

IGT血清(61例，年齡:(53±7)歲，收集于湖北宜昌地區，分安慰劑組和給藥組);正常人血清(19例，年齡:(52±8)歲，北京中日友好醫院提供);天芪降糖膠囊(黑龍江寶泉制藥有限公司提供);安慰劑膠囊(不含藥材，黑龍江寶泉制藥有限公司制備);標準品尿酸、肌苷、肌酸、肌酐、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺苷、胸苷、尿苷均購于sigma公司;色譜純甲醇(Fisher);超純水(18.2 MΩ)由Millipore系統制備;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1100液相色譜儀(二元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器);ABI公司API 3000(加拿大)三級四極桿串聯質譜儀;超速離心機(Labwayscience，德國);氮氣吹干儀(Organomation，美國);色譜柱:Agilent TC–C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

2 實驗方法

2.1 藥物干預模型建立

將61例IGT患者隨機分為安慰劑組(32人，年齡:(53 ±7)歲，男/女:17/15人)和給藥組(29人，年齡:(52±8)歲，男/女:13/16人)。兩組在飲食和運動基礎療法相同的基礎上，安慰劑組給予安慰劑膠囊，給藥組給予天芪降糖膠囊，正常對照組(19人，年齡:(52 ±8)歲，男/女:9/10人)不給藥。血清及臨床生化信息分別于給藥前、給藥3個月、給藥6個月收集或測量一次，臨床信息主要指標包括:空腹血糖、餐后2 h 血糖、TG、TC、HDL、LDL、血尿素氮(BUN)等。

2.2 血清樣本處理

在收集完整前，所有的血清樣本取樣后置于－80℃冰箱凍存。樣本處理在室溫下進行，取200 μL血清于離心管中，加800 μL甲醇，渦旋3 min，離心15 min(10 000 r/min)，上清液轉移至另一離心管中，常溫下N2吹干，再用100 μL氨水(0.002 mol/L)復溶，離心(12 000 r/min)15 min，取上清液注入HPLC–DAD–MS/MS分析。

2.3 色譜及質譜條件

色譜條件:Agilent TC–C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相 A:水(含 8 mmol/L 乙酸銨，用冰醋酸調pH=6.1)，流動相B:甲醇;流速:0.8 mL/min;檢測波長:275 nm;柱溫:25℃;梯度洗脫:0～7 min，100%A，7～10 min由100%水到95%A，10～30 min由95%水到75%A，30～35 min由75%A 到0%A;進樣量:20 μL。

質譜條件:ABI公司API 3000串聯質譜儀;數據采集在正離子模式下采用多反應監測模式(MRM);流速:0.15 mL/min(分流模式);離子源電壓5 000 V;離子源溫度350℃;Q1和Q3均采用unit分辨率且掃描時間為200 ms，霧化氣:14 L/min;氣簾氣:12 L/min;輔助干燥氣:4 L/min;碰撞氣:3 mTorr。

2.4 數據分析與統計

紫外和質譜數據峰面積提取后采用外標準曲線定量。數據用Excel進行統計分析，統計結果以±s表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，由方差齊性檢驗結果選擇方差齊或不齊。最后將處理后數據導入SIMCA－P(V11.5，Umetrics)中進行主成分聚類分析。

3 結果與分析

3.1 代謝物含量測定

本實驗室采用紫外–串聯質譜檢測器開發了一種同時定量上述9種嘌呤嘧啶類代謝物的方法［8］。為了獲得更好的檢測限及靈敏度，根據各個代謝物在紫外和質譜檢測器上的靈敏度和穩定性決定檢測器的選擇。經過對比分析發現尿酸、黃嘌呤、次黃嘌呤采用紫外定量較合適，而其他6種代謝物采用質譜定量更合適，本實驗亦采用上述方法。典型的IGT患者血清色譜和質譜圖如圖1所示。

3.2 IGT臨床轉化對比

根據世界衛生組織1999年對IGT和糖尿病的血糖診斷標準對61例IGT患者給藥前后血糖值進行統計，結果見表1。表1結果表明，生活方式干預和藥物干預對IGT的轉化均能取得較明顯的效果。在給藥前和給藥6個月后將安慰劑組和給藥組的空腹及餐后2h血糖值對比，結果發現給藥組在配合生活方式干預的基礎上轉化為正常血糖的比例明顯高于生活方式+安慰劑組，其中尤以餐后2 h血糖變化更為顯著(P＜0.015)，治療總有效性也高于生活方式+安慰劑組，而兩者轉化為糖尿病的比例相當。

圖19種代謝物紫外圖(A)和質譜圖(B)Fig.1 UV chromatogram(A)and multiple extracted ion chromatograms(B)of nine metabolites

表1 安慰劑組及給藥組給藥6個月后血糖轉化情況，例(%)Tab.1 The conversions of glucose between placebo group and treated group after 6 months＇medication administration/例(%)

3.3 幾種差異代謝物給藥前后比較

研究表明，糖尿病前期尿酸水平與胰島素抵抗及肌酐清除率關系緊密［9－11］。本實驗從定量的9種嘌呤嘧啶類代謝物的橫斷面統計分析結果來看，共發現3種代謝物與糖尿病前期IGT患者相關性較大，分別是尿酸、黃嘌呤、肌酐。實驗還發現尿酸與肌酐清除率呈負相關，這與文獻［9］報道一致，其他6種代謝物與正常組相比差異性較小。表2、表3、表4分別統計分析了給藥前、給藥3個月及給藥6個月后差異代謝物的含量變化。表2結果顯示:給藥前，正常組比給藥組及安慰劑組尿酸水平高。給藥后，與正常組比較，安慰劑組及給藥組尿酸水平均有向正常組靠攏的趨勢，但給藥組變化趨勢優于安慰劑組。表3結果顯示給藥前黃嘌呤比正常人有較明顯的升高，給藥后與尿酸呈現相同的變化趨勢，即向正常組靠攏。表4結果顯示給藥前安慰劑組和給藥組與正常組相比血清肌酐含量僅有細微變化，給藥后血清肌酐水平亦沒有明顯變化。此外，實驗中我們還發現IGT患者血尿酸氮(BUN)也維持在正常水平，因此從這兩者的結果提示IGT患者腎臟功能并無損傷，如文獻［9－10］報道血清肌酐的細微變化可能與胰島素抵抗等其他因素有關。此外，從結果發現各組間標準差相對較大，這可能與個體差異和藥物對個體干預的效果不同等因素有關。

表2 給藥后對尿酸代謝的影響(±s)Tab.2 The impact of uric acid metabolism after medication administration(ˉx ± s)

表2 給藥后對尿酸代謝的影響(±s)Tab.2 The impact of uric acid metabolism after medication administration(ˉx ± s)

注:與生活方式+給藥組給藥6個月相比，*P ＜0.02，***P＜0.1;與生活方式+給藥組給藥前相比，**P ＜0.002。

分組 例數 給藥前/(μg/mL)給藥3個月/(μg/mL)給藥6個月/(μg/mL)生活方式+安慰劑組32 30.29±13.38 32.25±13.49 38.00±10.17*生活方式+給藥組29 30.16±12.77 36.91±12.06 42.83±10.58**正常組 19 48.93±8.98***— —

表3 給藥后對黃嘌呤代謝的影響(±s)Tab.3 The impact of xanthine metabolism after medication administration(ˉx ± s)

表3 給藥后對黃嘌呤代謝的影響(±s)Tab.3 The impact of xanthine metabolism after medication administration(ˉx ± s)

注:與生活方式+給藥組給藥6個月相比，*P ＜0.1，***P＜0.005;與生活方式+給藥組給藥前相比，**P ＜0.01。

分組 例數 給藥前/(μg/mL)給藥3個月/(μg/mL)給藥6個月/(μg/mL)生活方式+安慰劑組32 0.428±0.101 0.353±0.104 0.325±0.102*生活方式+給藥組29 0.442±0.104 0.324±0.103 0.312±0.085**正常組 190.184±0.083***— —

表4 給藥后對肌酐代謝的影響(±s)Tab.4 The impact of creatinine metabolism after medication administration(ˉx ± s)

表4 給藥后對肌酐代謝的影響(±s)Tab.4 The impact of creatinine metabolism after medication administration(ˉx ± s)

注:與生活方式+給藥組給藥6個月相比，*P ＜0.2，***P ＜0.1;與生活方式+給藥組給藥前相比，**P ＜0.1。

分組 例數 給藥前/(μg/mL)給藥3個月/(μg/mL)給藥6個月/(μg/mL)生活方式+安慰劑組32 6.685±1.549 6.805±1.184 6.706±1.135*生活方式+給藥組29 6.441±1.436 6.577±1.8946.501±1.774**正常組 19 7.249±0.953***— —

3.4 藥物干預主成分聚類分析

鑒于個體差異及藥物對不同個體的干預效果不同，筆者還采用主成分分析法(PCA)對給藥前后的整體性趨勢進行評價。圖2是正常組及給藥組在給藥前、給藥3個月、給藥6個月主成分分析(PCA)得到的得分矩陣三維空間投影圖。其中的主成分包括9種代謝物及空腹和餐后2h血糖值。從圖2可以看出:四個組在空間中能明顯聚成4類但又緊密相連。此外，從圖2中還能明顯看出隨著給藥的進行，給藥3個月及給藥6個月均有向正常組靠近的趨勢，且隨著給藥時間的延長靠攏的趨勢越明顯。圖中結果提示嘌呤嘧啶代謝循環與糖尿病前期糖耐量受損有著密切的關聯。通過給藥前后的聚類對比分析我們推測天芪膠囊對糖尿病前期嘌呤嘧啶代謝循環具有較好的干預作用。

圖2 正常組與給藥組PCA投影圖Fig.2 The projection of PCA for normal group and treatment group

4 討論

長期以來，尿酸水平與糖尿病的關系一直存在著兩種截然相反的結論—高尿酸血癥與低尿酸血癥。近年來通過大量樣本的統計回歸分析發現高尿酸血癥與低尿酸血癥是糖尿病的兩種不同表型，糖尿病患者在早期無并發癥時，血尿酸水平降低，而當發展到存在并發癥時，血尿酸水平明顯升高［9］。此外，研究還發現在糖尿病早期胰島素抵抗明顯升高，同時血尿酸水平與胰島素抵抗值及肌酐清除率呈負相關［10］。從本實驗橫斷面的分析結果來看，嘌呤嘧啶代謝循環尤其是尿酸與糖耐量受損有較大的關聯。在此研究中我們發現糖尿病前期IGT患者尿酸及肌酐水平均有不同程度的降低，這也與上述糖尿病患者在患病早期的相關報道吻合，因此不難發現IGT患者嘌呤嘧啶代謝可能與糖尿病早期無并發癥時相似，其尿酸和肌酐降低可能和胰島素抵抗作用下高血糖和高尿糖在腎近曲小管競爭，抑制尿酸和肌酐的重吸收，使尿酸和肌酐排泄增加有關。此外，我們還發現IGT患者血清黃嘌呤升高明顯，這也提示IGT患者可能由于嘌呤嘧啶代謝紊亂導致黃嘌呤的生成增加或黃嘌呤氧化酶活性降低，進而導致黃嘌呤代謝紊亂產生低血尿酸。

目前，通過臨床及大鼠實驗已經發現天芪膠囊在調節血糖和血脂方面具有較好的療效。蔡寒青等［12］發現天芪降糖膠囊對胰島素及C－肽的分泌無明顯影響，可能通過改善靶細胞對胰島素的敏感性來發揮降糖作用。張茜等［13］利用基因芯片發現天芪降糖膠囊能明顯改善KKAy小鼠胰島素抵抗和脂代謝紊亂，他們還推測可能是通過 AMPKP38MAPK－GLUT4通路來改善葡萄糖的利用而達到降糖作用。從本實驗給藥前及給藥后TG、TC、HDL、LDL觀察結果我們發現亦能得到與文獻報道相似的結果。本研究旨在從嘌呤嘧啶代謝循環的角度考察天芪膠囊對IGT患者的干預作用。實驗發現天芪降糖膠囊對血糖及嘌呤嘧啶代謝循環具有較好的干預作用。在配合生活方式干預的基礎上給藥組尿酸、黃嘌呤等差異較顯著的代謝物均有向正常組轉化的趨勢。結合文獻報道及上述橫斷面和給藥的結果我們推測天芪降糖膠囊的降糖機制在改善嘌呤嘧啶代謝上可能與降低胰島素抵抗、增強胰島素敏感性促進機體對葡萄糖的利用等因素有關。

［1］Yang Wen－ying，Lu Ju－ming，Weng Jian－ping，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362(12):1090－1101.

［2］Rao SS，Disraeli P，Mcgregor T.Impaired glucose tolerance and impaired fasting glucose［J］.Am Fam Physician，2004，69(8):1961－1968.

［3］Facchini F，Chen YDI，Hollenbeck CB，et al.Relationship between resistance to insulin－mediated glucose－uptake，urinary uricacid clearance，and plasma uric－acid concentration ［J］.JAMA，1991，266(21):3008－3011.

［4］Abdul－Ghani MA，Matsuda M，Jani R，et al.The relationship between fasting hyperglycemia and insulin secretion in subjects with normal or impaired glucose tolerance［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，295(2):401－406.

［5］Xia Jian－fei，Liang Qiong－lin，Liang Xiao－ping，et al.Ultraviolet and tandem mass spectrometry for simultaneous quantification of 21 pivotal metabolites in plasma from patients with diabetic nephropathy［J］.J Chromatogr B，2009，877(20－21):1930－1936.

［6］Xia Jianfei，Hu Ping，Liang Qionglin，et al.Correlations of creatine and six related pyrimidine metabolites and diabetic nephropathy in Chinese type 2 diabetic patients［J］.Clin Biochem，2010，43(12):957－962.

［7］Xia Jianfei，Liang Qionglin，Hu Ping，et al.Correlations of six related purine metabolites and diabetic nephropathy in Chinese type 2 diabetic patients［J］.Clin Biochem，2009，42(3):215－220.

［8］Zhong Hongfu，Liang Qionglin，Xia Jianfei，et al.Simultaneous LC–UV–MS–MS analysis of nine pivotal metabolites in human serum:application to studies of impaired glucose tolerance［J］.Chromatographia，2011，73(1):149－155.

［9］Bo S，Cavallo－Perin P，Gentile L，et al.Hypouricemia and hyperuricemia in type 2 diabetes:two different phenotypes［J］.Eur JClin Invest，2001，31(4):318－321.

［10］Abdul－Ghani M，Matusda M，Sabbah M，et al.The relative contributions of insulin resistance and beta cell failure to the transition from normal to impaired glucose tolerance varies in different ethnic groups［J］.Diabetes Metab Syndr Clin Res Rev，2007，1(2):105－112.

［11］王 淼，趙 冬，王 薇，等.血清尿酸與胰島素敏感性及胰島素抵抗的關系［J］.中華內科雜志，2007，46(10):824－826.

［12］蔡寒青，葛煥琦，張秀娟，等.天芪降糖膠囊治療2型糖尿病60例臨床觀察［J］.吉林大學學報:醫學版，2003，29(5):669－671.

［13］張 茜，肖新華，王 彤，等.應用基因芯片探討天芪降糖膠囊降糖調脂的機制［J］.中國糖尿病雜志，2009，17(3):174－177.