薏苡仁注射液(康萊特)聯合順鉑對人肺腺癌細胞A549抑制作用及機制

呂品田， 周 坤， 王亞珍， 劉 斌

(1.河北省人民醫院腫瘤科，河北石家莊 050051;2.河北醫科大學第二醫院心內科，河北石家莊 050000)

肺腺癌是臨床常見的惡性度較高的腫瘤之一，發現時已多處于進展期，很難依靠手術達到根治目的。化療作為肺腺癌綜合治療的重要手段，在肺腺癌治療中發揮重要作用，但腫瘤多藥耐藥性(Multidrug resistance，MDR)的存在導致化療效果并不理想。故尋找新型藥物并逆轉腫瘤的MDR表型對提高化療效果、改善預后意義重大［1］。薏苡仁注射液(康萊特)以中藥薏苡仁提取物為主要成分，近期用于臨床肺腺癌治療已取得明顯效果，且該藥與化療藥物聯合應用具有抑制腫瘤的協同作用［2－3］，但關于該藥具體調節肺腺癌MDR表型的機制報道很少。因此，本研究應用康萊特及肺腺癌常用化療藥物順鉑(CDDP)作用于人肺腺癌細胞A549，對其對腫瘤細胞的抑制情況及調節腫瘤MDR的作用機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞株A549購自中國科學院上海細胞研究所，細胞置于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中培養，2～3 d傳代1次。正常細胞系人腦微血管內皮細胞HBMEC(Human brain microvascular endothelial cells)由本院科研中心保存。康萊特由浙江康萊特藥物有限公司提供;注射用順鉑粉針(CDDP，齊魯制藥有限公司)，調整藥物濃度為0.5μg/mL。將處于對數生長期的細胞經消化分散后計數，制成細胞懸液，各200μL/孔接種于96孔板內，分為康萊特組、CDDP組、康萊特+CDDP組及A549對照組，預培養24 h后，實驗各組分別加入康萊特及CDDP各20μL。每組設6個復孔;并設空白對照(RPMI 1640培養液)和正常對照孔(生理鹽水)，置于37°C，5%CO2培養箱培養48 h后進一步實驗。

1.2 SRB顯色法體外藥物敏感性實驗

培養結束后每孔加入預冷的50%的三氯醋酸(TCA)50μL，4℃放置1h以固定細胞，倒掉固定液，用超純水洗5遍，干燥后每孔加入100 μL SRB液，室溫避光放置10 min。棄去SRB，未與蛋白結合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空氣干燥，結合的SRB用150 μL 10 mmol/L非緩沖Tris堿液(pH10.5)溶解，545 nm處測定每孔OD值。腫瘤細胞平均抑制率(IR)=(1－給藥孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%。

1.3 逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)法檢測各MDR因子mRNA的表達

Trizol Reagent購自華美生物工程公司(Invitrogen公司產品)，一步法提取組織總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度法測定RNA的純度及含量。取2 μg RNA用于逆轉錄，20 μL 反應體系包括 Oligo(dT)0.1 μg，2 mmol/L dNTPs2.5 μL，Rnasin 0.1 μg 和 MMLV 200 U，反應條件42℃1 h，95℃5 min。每樣本分別取1μL逆轉錄產物建立40 μL PCR反應體系。以GAPDH作為內參照基因。PCR反應參數如下:96℃預變性4 min;然后94℃ 變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行30個循環;最后72℃延伸反應5 min。各因子引物序列如下:MDR1(438bp):引物(F)5’－CGCCAATGATGCTGCTCAAG－3’，(R)5 ’－ ACCAAGTAGGCTCCAAACCG－3 ’;Bcl－2(373bp):引物 (F)5’－AGAGGGGCTACGAGTGGGAT－3’，(R)5’－TCAAAGAAGGCCACAATCCTCC－3’;Bax(353bp):引 物 (F)5 ’－TTGCTTCAGGGTTTCATCCAG－3’，(R)5’－AAGTCCAATGTCCAGCCCAT－3’。RT－PCR 產物經 2% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，通過凝膠掃描儀進行DNA電泳條帶分析，各產物與GAPDH的比值作為表達水平的參數，進行PCR產物相對定量。

1.4 Western blot法檢測增殖、凋亡因子蛋白的表達

P－gp、Bcl－2、Bax 一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗均為美國Santa Cruz公司產品。收取每組107個對數生長期的腫瘤細胞，分別加入細胞裂解液100 μL，冰浴 20 min，使細胞充分裂解。4℃，8 000 r/min離心10 min，收集上清，Bradford法測定蛋白濃度。每組取40μg蛋白樣品，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，分別加入400倍稀釋的一抗，4℃過夜。加入二抗，漂洗后暗室曝光，常規顯影、定影。用BioRad圖像分析系統分析，以蛋白條帶的平均吸光度值(A值)表示蛋白表達的相對強度。

1.5 統計學處理

實驗數據用SAS8.0統計分析軟件分析。組間強度比值使用t檢驗，以P＜0.05為檢驗有統計學意義。

2 結果

2.1 康萊特聯合CDDP對A549細胞的體外抑制作用

各組細胞中，與對照組比較，康萊特組、CDDP組、康萊特 +CDDP組 OD值明顯降低(均P＜0.05)，以康萊特+CDDP組OD值降低最為明顯(P＜0.01);康萊特對正常細胞系HBMEC則無明顯抑制作用(P＞0.05)。見表1、圖1。

表1 康萊特、順鉑對A549細胞和正常細胞的體外抑制作用

圖1 各組細胞MDR1、Bcl-2、Bax mRNA表達水平

2.2 各組細胞 MDR1、Bcl－2、Bax mRNA 表達強度的比較

RT－PCR結果顯示，與對照組比較，康萊特組、CDDP 組、康萊特 +CDDP 組 P－gp和 Bcl－2 mRNA 強度均較空白對照組降低(均P＜0.05)，而Bax mRNA強度則明顯升高(P＜0.05);以康萊特+CDDP組變化最為顯著(均P＜0.01)。而康萊特對正常細胞系HBMEC的4種因子mRNA則無明顯影響(均P＞0.05)。見圖1。

2.3 組細胞 P－gp、Bcl－2、Bax Western Blot檢測結果的比較

Western Blot檢測結果顯示，與對照組比較，康萊特組、CDDP組、康萊特 +CDDP組 P－gp和 Bcl－2蛋白水平均較對照組降低(均P＜0.05)，而Bax蛋白水平則明顯升高(P＜0.05);以康萊特+CDDP組變化最為顯著。而康萊特對正常細胞系HBMEC的3種MDR因子蛋白水平則無明顯影響(均P＞0.05)。見圖2。

圖2 Western blot法檢測各組細胞MDR1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平

3 討論

康萊特主要成分為薏苡仁提取物，具有益氣養陰，消癖散結等功能，適用于氣陰兩虛，脾虛濕困型原發性非小細胞肺癌，該藥單獨應用或與化療藥物聯合應用已在非小細胞肺癌包括肺腺癌的治療方面取得了良好效果［2－3］。康萊特可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用［4－5］，但其與化療藥物聯合應用時是否有化療增敏效果及其與肺腺癌MDR關系的研究報道很少。本研究顯示，康萊特對肺腺癌細胞A549有明顯的抑制作用;該藥作用于A549后腫瘤細胞的耐藥相關因子MDR1/P－gp和凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)Bcl－2水平明顯降低，而促凋亡蛋白Bax則水平升高，說明康萊特可通過調節上述因子水平逆轉腫瘤MDR，達到抑制腫瘤的作用，但由于腫瘤MDR調控是多途徑、網絡式調節，康萊特具體參與了哪些途徑還有待進一步深入研究。本結果還顯示康萊特對于人正常細胞(人腦微血管內皮細胞HBMEC)無明顯抑制作用，對該細胞的MDR因子水平也無顯著影響，說明康萊特在用于肺腺癌治療中有較強的選擇性，對正常組織毒副作用較低，是較為理想的肺腺癌治療用藥。

肺腺癌由于起病隱匿，不易早期發現，患者就診時多已處于進展期或晚期，手術難以達到徹底根治或已失去手術機會。故目前包括化療在內的各種措施在該病的治療中發揮著主要作用，而肺腺癌腫瘤細胞具有的MDR特性常導致化療失敗［6］，結合中藥治療以提高化療效果、減輕毒副反應已成為當前臨床研究的熱點［7］。目前已有報道康萊特與化療藥物聯合應用對腫瘤細胞殺傷有協同作用［3，8］，但具體機制尚無明確報道。故本研究對康萊特聯合化療藥物CDDP對A549細胞系的作用情況進行了研究。結果顯示，康萊特聯合CDDP對A549的殺傷率較單獨應用放療更強，該作用是通過抑制DR1/P－gp的藥泵作用和凋亡抑制蛋白Bcl－2的抗凋亡作用，同時促進Bax的促凋亡作用而實現的。這說明康萊特具有MDR逆轉作用，與化療藥物聯合使用可提高腫瘤細胞的化療敏感性。

本研究初步證實康萊特可通過逆轉肺腺癌細胞的MDR來增強化療效果，與化療具有協同作用。但本研究僅檢測了部分MDR相關因子在用藥前后水平的變化，對其中轉導通路等具體機制尚未進行深入研究;體外細胞系研究也與臨床研究存在較大差距。有待更深入研究其作用機制并應用體內實驗予以驗證，以期確定合適的康萊特與化療聯合作用方式，改善肺腺癌治療的效果。

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