p38MAPK活化在苦參堿誘導Raji細胞凋亡中作用的研究

劉占術(shù)， 羅章琴， 張紅賓， 陳建斌*， 楊澤松， 黃 曦， 黃宗干

(1.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院血液內(nèi)科，重慶 402160;2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，重慶 400016;3.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院腫瘤血液中心，重慶 401520)

細胞為研究對象，探討苦參堿在誘導Raji細胞凋亡過程中對凋亡信號轉(zhuǎn)導通路交匯點的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase ，p38MAPK)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 苦參堿由吉林玉皇藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，分 子量 248.36，批 準文 號:國 藥準 字H20031000，產(chǎn)品批號:20080908，5mL:50mg，4℃ 保存。

1.2 主要試劑與器材 Annexin V－FITC/PI雙標記染色試劑盒、蛋白提取試劑盒以及ECL發(fā)光試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);P－p38MAPK與Caspase－3抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);β－actin抗體以及羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司);BCA試劑盒以及SB203580(碧云天生物技術(shù)研究所);FACStar－plus型流式細胞儀(BD公司，美國)，凝膠圖像分析儀(Bio－Rad公司，美國)。

1.3 細胞 Raji細胞株由重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院惠贈。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) Raji細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，另加青霉素和鏈霉素各100U/mL，于37℃、5%CO2的飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，2－3d換液傳代1次。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4.2 AnnexinV－FITC/PI雙標記染色檢測Raji細胞凋亡率 根據(jù)本課題前期實驗研究［5］，收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為2×105個/mL，接種于7個100 mL的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，取其中3個培養(yǎng)瓶加入苦參堿(終濃度為0.4 mg/mL，0.8 mg/mL，1.6 mg/mL)，再取3個培養(yǎng)瓶先加入10μmol/L SB203580 1 h后加入苦參堿(終濃度同上)，并設(shè)立對照組，作用Raji細胞48 h后，2 000 r/min，離心5 min，4℃預冷的 PBS洗滌2次，收集細胞后，按照

AnnexinV－FITC/PI雙標記染色參考試劑盒說明書操作，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取平均值。

1.4.3 Western blot檢測 P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白表達量的變化 細胞處理同上，每組收集1×107個以上細胞，用預冷的PBS洗滌3次，3 000 r/min，5 min后，棄上清，然后按照蛋白提取試劑盒說明進行操作，最終得到蛋白提取物。用BCA法測定蛋白濃度，取總蛋白30μg，算出每組的上樣量后加入配好的10%SDS－PAGE進行凝膠電泳(濃縮膠:60 V，30 min;分離膠:100 V，1 h)分離目的蛋白;然后在250 mA，1 h條件下將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含5 g脫脂奶粉的TBST 100 mL，室溫封閉2 h;分別加1∶200稀釋的兔抗人P－p38MAPK和1∶100稀釋的Caspase－3抗體，4℃孵育過夜，用TBST漂洗10 min×3次;加1∶3 000稀釋的過氧化物酶結(jié)合的二抗，室溫孵育2 h;用TBST漂洗10 min×3次，然后進行ECL發(fā)光，用凝膠圖像分析儀曝光拍照。將硝酸纖維素膜用洗脫液漂洗1 h以去除上一次結(jié)合的抗體，再分別與1∶500稀釋的抗βactin抗體4℃孵育，漂洗，孵育二抗再漂洗后，掃描蛋白印跡條帶。實驗重復3次。采用Quantity One分析軟件對目的蛋白條帶進行灰度掃描，結(jié)果用目的蛋白/β－actin灰度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對Raji細胞凋亡的影響0.4、0.8、1.6 mg/mL

苦參堿作用Raji細胞48 h后，其總凋亡率分別為(15.77±0.53)%、(27.88±1.52)%、(48.08±2.87)%，與加入SB203580比較(11.48±0.64)%、(19.34±0.91)%、(33.98±1.26)%具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，與對照組(8.78±0.66)%相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01);苦參堿不同濃度組間比較也具有統(tǒng)計差異(P＜0.05，P＜0.01)(見圖1、2)。

2.2 苦參堿對 Raji細胞 P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白含量的影響

圖1 不同濃度Mat以及在此基礎(chǔ)上加入SB203580后誘導Raji細胞凋亡Fig.1 Apoptosis of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580

圖2 不同濃度Mat以及在此基礎(chǔ)上加入SB203580后誘導Raji細胞凋亡率(ˉx ±s，%，n=3)Fig.2 Apoptosis rate of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580(ˉx ± s，% ，n=3)

如圖3所示，0.4、0.8、1.6 mg/mL苦參堿作用Raji細胞 48h后，P－p38MAPK灰度比值分別為(1.06±0.05)、(1.98±0.07)、(3.43±0.11)，與對照組(0.61±0.04)比較具有統(tǒng)計差異(P＜0.01)，在加入抑制劑后其灰度比值分別為(0.76±0.04)、(1.53±0.06)、(2.60±0.09)，加入抑制劑前后相比較差異顯著(P＜0.01);同樣，Caspase－3灰度比值分別為(0.53±0.01)、(1.03±0.02)、(1.49±0.02)，與對照組(0.36±0.01)比較有統(tǒng)計差異(P＜0.01)，加入抑制劑后其灰度比值分別為(0.42±0.02)、(0.76±0.02)、(1.12±0.02)，加入抑制劑前后相比較也具有明顯差異(P＜0.01)，通過相關(guān)性分析，二者明顯相關(guān)(r=0.944);在苦參堿各濃度組之間，P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白差異顯著(P＜0.01)。

圖3 各組Raji細胞P-p38MAPK、caspase-3蛋白的表達Fig.3 The expression of P-p38MAPK and caspase-3 protein in every Raji cell groups

3 討論

Burkitt＇s淋巴瘤是具有高度侵襲性的B細胞腫瘤，目前治療主要采用大劑量化療，雖其完全緩解率為75% ～90% ，總生存率達50% ～70%，但因化療副作用極大和化療后極易復發(fā)［6］，使尋求高效低毒抗腫瘤藥物成為必要。最近研究表明［1－5］作為傳統(tǒng)中藥的苦參堿具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，目前對其機制主要集中在對 p53、Fas、FasL、Bax、Bcl－2 等基因的研究［7－9］，對 p38MAPK 在該機制中的研究較少，本實驗以Raji細胞為研究對象，通過檢測P－p38MAPK(活化的 p38MAPK)，來證明 P－p38MAPK與苦參堿誘導Raji細胞凋亡的相關(guān)性。

p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路是生物信號引起核反應(yīng)的重要通路，激活的P38MAPK通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控特定基因表達，導致蛋白合成、細胞表面受體表達、細胞骨架重構(gòu)，最終導致細胞的凋亡［10］。本研究流式細胞儀結(jié)果顯示細胞凋亡率隨苦參堿的濃度的提高而增加，在加入p38MAPK抑制劑后，凋亡率有所下降，這說明P－p38MAPK與苦參堿誘導Raji細胞凋亡具有相關(guān)性。為此，本研究又采用Western blot檢測了P－p38MAPK和 Caspase－3蛋白的含量，結(jié)果顯示隨苦參堿濃度的增加，二者表達量均增加，在加入p38MAPK抑制劑后，二者表達降低，這與細胞凋亡率的結(jié)果一致，同時，相關(guān)性分析結(jié)果也顯示 P－p38MAPK與 Caspase－3明顯相關(guān)，這在Wang等［6］的研究中也得到證實。

目前p38MAPK通路與細胞凋亡的機制尚不清楚，Wang 等［11］發(fā)現(xiàn) Fas－放線菌素 D 誘導 Bel－7402細胞凋亡是通過p38MAPK在細胞核與Caspase－3結(jié)合后激活 Caspase－3實現(xiàn)的。張玉軍等［12］卻發(fā)現(xiàn)p38MAPK上調(diào)Fas/FasL導致Caspase－3活化，促進細胞凋亡，因此推測p38MAPK在凋亡過程中具有雙重作用，但最后凋亡的執(zhí)行都是由活化的Caspase－3 完成的。

綜上所述，我們研究表明苦參堿可通過激活p38MAPK來直接或間接激活Caspase－3蛋白，進而使Raji細胞凋亡，該機制的闡明為苦參堿抗腫瘤作用提供充分的理論依據(jù)。

［1］程向東，杜義安，黃 靈，等.苦參堿在調(diào)解Bax和Bcl－2蛋白表達誘導Hep G2細胞凋亡中的作用［J］.中國腫瘤臨床，2008，35(12):711－713.

［2］盧前微，陳建斌，湯為學，等.苦參堿對U937細胞周期調(diào)控蛋白的影響［J］.中成藥，2009，31(11):1658－1661.

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［4］張金廷，崔慧先，李慶星，等.苦參堿對KB及其多藥耐藥細胞KBv200增殖與凋亡影響的對比研究［J］.中國腫瘤臨床，2005，32(9):520－523.

［5］劉占術(shù)，陳建斌，湯為學，等.苦參堿對Raji細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Fas/FasL表達的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2009，30(22):2561－2564.

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［8］方 政，趙軍方，李新明，等.苦參堿對人涎腺腺樣囊性癌細胞增殖抑制及 PCNA、c－myc、p53 蛋白表達的影響［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(19):28－30.

［9］楊澤松，牟 君，陳建斌，等.苦參堿誘導U937細胞凋亡及其對 Bcl－2表達的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2008，29(24):2244－2247.

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［11］Wang Y，Sun L，Xia C，et al.p38MAPK regulates caspase－3 by binding to caspase－3 in nucleus of human hepatoma Bel－7402 cells during anti－Fas antibody－and actinomycin D－induced apoptosis［J］.Biomed Pharmacother，2009，63(5):343－350.

［12］張玉軍，劉淑霞，劉青娟，等.p38/Fas/FasL在戊地昔布誘導食管癌裸鼠移植瘤細胞凋亡中的調(diào)控作用［J］.中國藥理學通報，2009，25(8):1081－1085.