p38MAPK活化在苦參堿誘導Raji細胞凋亡中作用的研究

劉占術， 羅章琴， 張紅賓， 陳建斌*， 楊澤松， 黃 曦， 黃宗干

(1.重慶醫科大學附屬永川醫院血液內科，重慶 402160;2.重慶醫科大學附屬第一醫院血液內科，重慶 400016;3.重慶市合川區人民醫院腫瘤血液中心，重慶 401520)

細胞為研究對象，探討苦參堿在誘導Raji細胞凋亡過程中對凋亡信號轉導通路交匯點的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase ，p38MAPK)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 苦參堿由吉林玉皇藥業有限公司生產，分 子量 248.36，批 準文 號:國 藥準 字H20031000，產品批號:20080908，5mL:50mg，4℃ 保存。

1.2 主要試劑與器材 Annexin V－FITC/PI雙標記染色試劑盒、蛋白提取試劑盒以及ECL發光試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司);P－p38MAPK與Caspase－3抗體(北京博奧森生物技術有限公司);β－actin抗體以及羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司);BCA試劑盒以及SB203580(碧云天生物技術研究所);FACStar－plus型流式細胞儀(BD公司，美國)，凝膠圖像分析儀(Bio－Rad公司，美國)。

1.3 細胞 Raji細胞株由重慶醫科大學附屬兒童醫院惠贈。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養 Raji細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，另加青霉素和鏈霉素各100U/mL，于37℃、5%CO2的飽和濕度的孵箱中培養，2－3d換液傳代1次。取對數生長期細胞進行實驗。

1.4.2 AnnexinV－FITC/PI雙標記染色檢測Raji細胞凋亡率 根據本課題前期實驗研究［5］，收集對數生長期細胞，調整細胞密度為2×105個/mL，接種于7個100 mL的培養瓶進行培養，取其中3個培養瓶加入苦參堿(終濃度為0.4 mg/mL，0.8 mg/mL，1.6 mg/mL)，再取3個培養瓶先加入10μmol/L SB203580 1 h后加入苦參堿(終濃度同上)，并設立對照組，作用Raji細胞48 h后，2 000 r/min，離心5 min，4℃預冷的 PBS洗滌2次，收集細胞后，按照

AnnexinV－FITC/PI雙標記染色參考試劑盒說明書操作，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取平均值。

1.4.3 Western blot檢測 P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白表達量的變化 細胞處理同上，每組收集1×107個以上細胞，用預冷的PBS洗滌3次，3 000 r/min，5 min后，棄上清，然后按照蛋白提取試劑盒說明進行操作，最終得到蛋白提取物。用BCA法測定蛋白濃度，取總蛋白30μg，算出每組的上樣量后加入配好的10%SDS－PAGE進行凝膠電泳(濃縮膠:60 V，30 min;分離膠:100 V，1 h)分離目的蛋白;然后在250 mA，1 h條件下將目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。用含5 g脫脂奶粉的TBST 100 mL，室溫封閉2 h;分別加1∶200稀釋的兔抗人P－p38MAPK和1∶100稀釋的Caspase－3抗體，4℃孵育過夜，用TBST漂洗10 min×3次;加1∶3 000稀釋的過氧化物酶結合的二抗，室溫孵育2 h;用TBST漂洗10 min×3次，然后進行ECL發光，用凝膠圖像分析儀曝光拍照。將硝酸纖維素膜用洗脫液漂洗1 h以去除上一次結合的抗體，再分別與1∶500稀釋的抗βactin抗體4℃孵育，漂洗，孵育二抗再漂洗后，掃描蛋白印跡條帶。實驗重復3次。采用Quantity One分析軟件對目的蛋白條帶進行灰度掃描，結果用目的蛋白/β－actin灰度值之比表示。

2 結果

2.1 苦參堿對Raji細胞凋亡的影響0.4、0.8、1.6 mg/mL

苦參堿作用Raji細胞48 h后，其總凋亡率分別為(15.77±0.53)%、(27.88±1.52)%、(48.08±2.87)%，與加入SB203580比較(11.48±0.64)%、(19.34±0.91)%、(33.98±1.26)%具有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，與對照組(8.78±0.66)%相比較差異具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01);苦參堿不同濃度組間比較也具有統計差異(P＜0.05，P＜0.01)(見圖1、2)。

2.2 苦參堿對 Raji細胞 P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白含量的影響

圖1 不同濃度Mat以及在此基礎上加入SB203580后誘導Raji細胞凋亡Fig.1 Apoptosis of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580

圖2 不同濃度Mat以及在此基礎上加入SB203580后誘導Raji細胞凋亡率(ˉx ±s，%，n=3)Fig.2 Apoptosis rate of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580(ˉx ± s，% ，n=3)

如圖3所示，0.4、0.8、1.6 mg/mL苦參堿作用Raji細胞 48h后，P－p38MAPK灰度比值分別為(1.06±0.05)、(1.98±0.07)、(3.43±0.11)，與對照組(0.61±0.04)比較具有統計差異(P＜0.01)，在加入抑制劑后其灰度比值分別為(0.76±0.04)、(1.53±0.06)、(2.60±0.09)，加入抑制劑前后相比較差異顯著(P＜0.01);同樣，Caspase－3灰度比值分別為(0.53±0.01)、(1.03±0.02)、(1.49±0.02)，與對照組(0.36±0.01)比較有統計差異(P＜0.01)，加入抑制劑后其灰度比值分別為(0.42±0.02)、(0.76±0.02)、(1.12±0.02)，加入抑制劑前后相比較也具有明顯差異(P＜0.01)，通過相關性分析，二者明顯相關(r=0.944);在苦參堿各濃度組之間，P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白差異顯著(P＜0.01)。

圖3 各組Raji細胞P-p38MAPK、caspase-3蛋白的表達Fig.3 The expression of P-p38MAPK and caspase-3 protein in every Raji cell groups

3 討論

Burkitt＇s淋巴瘤是具有高度侵襲性的B細胞腫瘤，目前治療主要采用大劑量化療，雖其完全緩解率為75% ～90% ，總生存率達50% ～70%，但因化療副作用極大和化療后極易復發［6］，使尋求高效低毒抗腫瘤藥物成為必要。最近研究表明［1－5］作為傳統中藥的苦參堿具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，目前對其機制主要集中在對 p53、Fas、FasL、Bax、Bcl－2 等基因的研究［7－9］，對 p38MAPK 在該機制中的研究較少，本實驗以Raji細胞為研究對象，通過檢測P－p38MAPK(活化的 p38MAPK)，來證明 P－p38MAPK與苦參堿誘導Raji細胞凋亡的相關性。

p38MAPK信號轉導通路是生物信號引起核反應的重要通路，激活的P38MAPK通過磷酸化多種轉錄因子，調控特定基因表達，導致蛋白合成、細胞表面受體表達、細胞骨架重構，最終導致細胞的凋亡［10］。本研究流式細胞儀結果顯示細胞凋亡率隨苦參堿的濃度的提高而增加，在加入p38MAPK抑制劑后，凋亡率有所下降，這說明P－p38MAPK與苦參堿誘導Raji細胞凋亡具有相關性。為此，本研究又采用Western blot檢測了P－p38MAPK和 Caspase－3蛋白的含量，結果顯示隨苦參堿濃度的增加，二者表達量均增加，在加入p38MAPK抑制劑后，二者表達降低，這與細胞凋亡率的結果一致，同時，相關性分析結果也顯示 P－p38MAPK與 Caspase－3明顯相關，這在Wang等［6］的研究中也得到證實。

目前p38MAPK通路與細胞凋亡的機制尚不清楚，Wang 等［11］發現 Fas－放線菌素 D 誘導 Bel－7402細胞凋亡是通過p38MAPK在細胞核與Caspase－3結合后激活 Caspase－3實現的。張玉軍等［12］卻發現p38MAPK上調Fas/FasL導致Caspase－3活化，促進細胞凋亡，因此推測p38MAPK在凋亡過程中具有雙重作用，但最后凋亡的執行都是由活化的Caspase－3 完成的。

綜上所述，我們研究表明苦參堿可通過激活p38MAPK來直接或間接激活Caspase－3蛋白，進而使Raji細胞凋亡，該機制的闡明為苦參堿抗腫瘤作用提供充分的理論依據。

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