當歸四逆湯中阿魏酸在大鼠血清中含量測定及藥動學研究

高宇勤， 趙國平*， 江仁望

(1.暨南大學醫學院2.暨南大學藥學院，廣東廣州 510632)

當歸四逆湯出自《傷寒論》，由當歸、白芍、桂枝、細辛、甘草、通草、大棗等7味藥組成。該方溫經散寒、養血通脈，具有擴張血管，改善微循環，降低血液黏稠度［1］，抗凝、抗炎、鎮痛［2］，改善心肌血氧供應［3］等作用。臨床主要用于血虛寒厥證，治療雷諾氏病［4］、冠心病［5］、糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥［6］等。有報道證實在該方乙醇提取液中含有阿魏酸［7］，而阿魏酸具有強抗氧化能力及清除自由基作用［8－11］，對于冠心病和一部分癌癥有治療作用［12－15］，可能是當歸四逆湯治療作用的其中一個重要的物質基礎。但在當歸四逆湯水煎劑中是否存在阿魏酸，該方口服后血清中是否也含有阿魏酸，經當歸四逆湯配伍應用后阿魏酸的血液動力學有何改變，均值得探討。為此，本實驗探究當歸四逆湯水煎劑中是否也含有阿魏酸及當歸四逆湯水煎劑大鼠灌胃后其中成分阿魏酸是否入血及其藥代動力學規律。

1 儀器與實驗材料

1.1 實驗設備

Agilengt 1200高效液相色譜儀(美國Agilent)，RE－52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，BS110型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.2 實驗藥品

甲醇、乙腈均為色譜純，正丁醇，冰醋酸為分析純，實驗用水為三重蒸餾水，阿魏酸標準品(批號:ZL20090425AWS)購自南京澤朗醫藥科技有限公司，當歸四逆湯(當歸、白芍、桂枝、細辛、甘草、通草、大棗等按4∶3∶3∶1∶2∶2∶1比例混合)藥物飲片購自廣東中醫藥大學第一附屬醫院。當歸四逆湯按照中藥煎藥常規煎，經減壓旋轉濃縮成每毫升相當于1 g生藥的混懸液。

1.3 實驗動物

SD大鼠，250～300 g，♀♂各半，由南方醫科大學動物實驗中心提供。

2 方法

2.1 動物分組及含藥血清的收集

42只SD大鼠，隨機分成7組，灌胃后 30、60、90、120、180、360、540 min 共 7 個時間點腹主動脈取血，每個時間點為一組，每組6只，♀♂各半，于灌胃前一天晚上禁食，飲水不限。按20 g/kg灌胃給予當歸四逆湯水煎液，具體方法:腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉動物，每只大鼠開腹，于腹主動脈取血5～6 mL，置于離心管內，靜置1 h，離心(4 000 r/min，15 min，6℃)，棄去沉淀，取上清液 2 mL，加正丁醇 8 mL，混勻 3 min，加乙酸 20 μL，離心4 000 r/min，25 min，4 ～6℃，取上清液于尖底離心管中40℃水浴，氮氣吹干，1 mL甲醇定容，并微孔濾膜過濾，10 μL 進樣。

2.2 標準品配制

利用二甲基亞砜溶解阿魏酸，并配成50 mmol/L貯備液，從標準貯備液中取阿魏酸，取4個濃度點(2 × 10－5、4 × 10－5、2 × 10－5，8 × 10－5，16 × 10－5mol/L)繪制標準曲線，上述標準品加空白血清2 mL，加正丁醇 8 mL，混均 3 min，加乙酸 20 μL，離心4 000 r/min，25 min，4 ～6℃，取上清液于尖底離心管中40℃水浴氮氣吹干，1 mL甲醇定容，并微孔濾膜過濾，10 μL 進樣。

圖1 標準品對照HPLC圖譜

2.3 色譜條件

色譜柱:Capcell PAK C18size 250 mm×4.6 mm，TYPE MGⅡ5 μm，柱溫20℃。梯度洗脫見表1，流速為1.0 mL/min，檢測波長有230 nm、275 nm、254 nm、320 nm，進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

3結果

當歸四逆湯水煎劑經正丁醇萃取后，經高效液相色譜法測定發現在檢測波長320 nm圖譜上存在阿魏酸峰，按前述樣品處理方法處理標準品，經HPLC測定(見圖1)標準品阿魏酸面積(Y)并計算Y對阿魏酸血藥濃度之間的回歸方程，方程為Y=5.141+3.62X，r=0.998 7，P＜0.01(Y為阿魏酸峰面積，X為阿魏酸濃度，單位為10－5mol/L)，樣品及空白血清經上述方法處理，經HPLC測定，圖譜見(圖2、3)根據標準曲線，算出樣品中的阿魏酸的濃度結果，見表2，并繪制出阿魏酸濃度對于時間的曲線，見圖4，上述濃度數據使用藥代動力學計算程序(3P97)進行曲線擬合，得出大鼠口服當歸四逆湯后，其有效成分阿魏酸的藥代動力學參數見表3，統計矩結果見表4，結果表明當歸四逆湯口服后，其中阿魏酸有效成分在大鼠體內的藥時過程符合一室模型(根據最小AIC準則)權重1/C2，Cmax 7.988 771 mg/L，AUC 7861.507 80 mg/(L·min)，總體表現為口服后吸收快，消除慢。

圖2 血清樣品HPLC圖譜

表2 口服當歸四逆湯后阿魏酸在大鼠體內的藥-時曲線(±s)

表2 口服當歸四逆湯后阿魏酸在大鼠體內的藥-時曲線(±s)

30 min 60 min 90 min 120 min 180 min 360 min 540 min阿魏酸/(mg/L) 5.7±0.52 6.80±1.90 7.60±0.43 7.80±0.98 8.31±1.17 6.99±0.93 4.98±0.50

圖3 空白血清HPLC圖譜

圖4 口服當歸四逆湯后阿魏酸血清濃度對時間的關系

表3 大鼠口服當歸四逆湯后血清阿魏酸的藥代動力學參數

表4大鼠口服當歸四逆湯后血清阿魏酸的統計矩結果

4 討論

阿魏酸具有抗氧化和抗自由基活性［8－11］，當歸四逆湯乙醇提取液含有阿魏酸［7］，但是該方水煎劑是否還含有阿魏酸尚未見報道。本實驗結合文獻報道的阿魏酸的高效液相色譜梯度洗脫程序［7］最后采取了表1程序，通過高效液相色譜(HPLC)首次發現當歸四逆湯水煎劑在320 nm波長的圖譜上含有阿魏酸(有研究發現320nm波長比較適合阿魏酸檢測［16］，試驗中證實了這一點)而且口服當歸四逆湯水煎劑后大鼠血清中也存在阿魏酸，說明阿魏酸應是當歸四逆湯的一個有效成分，

阿魏酸單體及當歸、川芎等單味藥中的阿魏酸在不同動物及人體的藥動學已有少量報道［17－19］，多為一室模型，口服給藥后血藥濃度下降迅速，部分復方中阿魏酸口服后體內分布與代謝為二室模型［20］，本實驗發現給大鼠口服當歸四逆湯后阿魏酸的藥代動力學為Cmax 7.988 771 mg/L，AUC 7 861.507 80 mg/(L·min)，在大鼠體內的藥時過程符合一室模型(根據最小AIC準則)權重1/C2，口服吸收快，但是消除慢，與文獻報道有差異［［16－22］。我們分析造成阿魏酸藥代動力學差異的原因可能有以下兩點:首先是不同的動物對同一種物質代謝不同;其次是不同的處方合劑中多種物質相互影響造成，比較我們的實驗結果和已有報道也說明復方制劑中多種成分可能對阿魏酸在大鼠體內的藥動學過程有明顯影響。

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