大承氣顆粒中大黃酚在大鼠體內血藥濃度的含量測定

劉俊紅， 方步武， 伍孝先， 李棣華， 吳咸中

(1.天津市中西醫結合急腹癥研究所，天津 300100;2.天津醫科大學，天津 300070)

大承氣顆粒與《傷寒論》中大承氣湯的處方組成相同(大黃、厚樸、枳實、芒硝)，作為醫院制劑在天津市南開醫院用于急腹癥的中西醫結合治療已20余年。目前我院采用先進工藝提取精制的大承氣顆粒，用于腸梗阻［1］、急性胰腺炎［2］、內毒素血癥［3］及其它腹腔感染性疾病［4］的治療，取得滿意療效。有文獻報道大黃酚在兔體內血藥濃度的測定［5-6］，金氏痔瘡膏或通脈活血靈膠囊制劑中大黃酚的HPLC測定［7-8］，但大承氣復方中大黃有效成分的血藥濃度測定未見報道。本研究的系列工作表明，大承氣顆粒給大鼠灌胃后，大黃的主要成分可被吸收入血［9］，其血清中大黃酚的測定不受方中其它成分和空白血清的干擾，從而建立了測定大承氣顆粒中大黃酚的血藥濃度的HPLC，并初步分析了其血藥濃度的變化，為大承氣顆粒的進一步研究和應用奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 動物

Wistar大鼠10只，清潔級，軍事醫學科學院第四研究所動物室提供，體重200 g～250 g，♀♂兼用。

1.2 儀器

日本島津LC-10ATvp高效液相色譜儀;SPD-10Avp紫外-可見光檢測器;數據處理使用SSI分析之星工作站;日本島津Libror AEG-120萬分之一天平;LXJ-64-01型離心機(北京醫療儀器修理廠)。

1.3 藥品與試劑

大承氣顆粒(天津市南開醫院藥物研究室制備);大黃酚對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號0796-9404);乙腈、甲醇均為色譜純，氯仿、高氯酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 大鼠用藥劑量和藥物血清制備

大承氣顆粒單次用藥劑量為1.205 g/kg，配成濃度為0.2 g/mL的混懸液，用前充分搖勻;大鼠灌胃 0.602 5 mL/100 g，分別于灌胃后30 min、45 min、1、1.5、3、6、12、24 h 大鼠球后靜脈叢采血，各時間點采血均約 1 mL，離心 3 500 r/min，20 min，血清分裝，－20℃凍存。

2.2 血清樣品的處理

分別將不同時間段的血清解凍，精密吸取500 μL置于10 mL離心管中，精密加入1 mL高氯酸，振搖1 min，再精密加入氯仿提取2次，每次5 mL，振搖 1 min，離心(4 000 r/min，20 min)，吸取氯仿層合并，過0.45 μm微孔濾膜，冷風吹干，殘留物用甲醇100 μL溶解作為樣品液。

2.3 色譜條件

色譜柱kromasil C18250 mm×4.6 mm，流動相:甲醇-水(含1%高氯酸)80∶20，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，靈敏度 0.01 AUFS，進樣20 μL，室溫。

2.4 標準曲線的制備

取約10 mg大黃酚對照品，精密稱定，加入50 mL量瓶中用乙腈稀釋至刻度，作為貯備液。從中精密吸取0.1、0.2、0.6、0.8、1.0 mL 加入 5 mL 量瓶，用乙腈稀釋至刻度，再從濃度最低一份標準溶液中精密吸取2.5 mL用乙腈溶解于10 mL量瓶中。進樣20 μL，測定峰面積，繪制AU-C曲線圖，線性方程為Y=1.060×10－5X+3.027 ×10－1，相關系數r=0.999 7。

2.5 校正曲線的制備

從上述標準溶液中的五個濃度，分別精密吸取100 μL置于10 mL離心管中，冷風吹干，加入500 μL空白血清，按2.3項下操作，進樣20 μL，測定峰面積，繪制AU-C曲線圖，線性方程為Y=1.050×10－5X+2.034 ×10－1，相關系數r=0.999 9，線性范圍為0.855 μg/mL。按上述色譜條件測定血清中大黃酚最低檢測濃度為0.855 μg/mL。

2.6 回收率及精密度試驗

分別取高、中、低三個濃度的大黃酚標準液，各精密吸取100 μL，加入到10 mL具塞離心管中，冷風吹干，加入500 μL空白血清溶解，再按2.2項下處理后進樣測定，與相應對照品峰面積比較計算回收率。并且于日內不同時間和不同的日間分別進樣測定，計算日內標準偏差和日間標準偏差，結果見表1。

表1 回收率及精密度試驗

2.7 重現性試驗

分別取大鼠灌胃1 h、6 h后的血清，各5份，再按2.2項下“精密吸取500 μL……作為樣品液”處理后進樣測定，進樣20 L。結果血清樣品中大黃酚RSD值分別為6.66%、7.18%。

2.8 穩定性試驗

分別精密吸取濃度為1.14 μg/mL和27.36 μg/mL的大黃酚標準液100 μL，分別加入到10 mL具塞離心管中，冷風吹干，加入500 μL空白血清溶解，再按2.2項下“精密加入1 mL高氯酸……作為樣品液”處理，分別于 0、4、8、24、48 h 進樣測定，進樣20 L。結果血清樣品中大黃酚在48 h內RSD值分別為5.53%、2.28%，穩定性良好。

2.9 結果

2.9.1 大承氣顆粒中大黃酚的含量測定 按照報道的方法［10］制備大承氣顆粒并測定其中的大黃酚含量為5.98 mg/g。

2.9.2 空白血清色譜行為 取空白血清500 μL，按2.2項下操作。進樣檢測，血清中雜質不干擾大黃酚的含量測定。

2.9.3 大黃酚血藥濃度測定及血藥濃度—時間曲線圖 將按2.2項法處理過的不同時間段血清樣品進樣20 μL，用外標法測定，色譜圖見圖1-A。每個時間點取3只大鼠，取其平均值，以橫坐標為不同取血時間，縱坐標為大黃酚的濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，見圖2。由圖中可以看出，在灌胃1h后大黃酚的含量達到峰值，出現兩個吸收峰值。

圖1 含藥血清、空白血清和標準品的HPLC圖

圖2 大黃酚血藥濃度—時間曲線

3 討論

3.1 檢測指標的確定

本提取方法能分離出大承氣顆粒中大黃四種蒽醌類成分，見圖1-A、1-C。但用缺項大黃的復方作為陰性對照藥給大鼠灌胃，1 h后采血，經同法提取測定，色譜圖中對應于蘆薈大黃素、大黃酸處有干擾峰，與復方質量標準測定結果相似;大黃素體內含量較低，而且空白血漿對其略有干擾;大黃素甲醚微量，忽略不計，因此，選用大黃酚作為指標測定。

3.2 溫度對檢測的影響

溫度對出峰時間影響很大，本研究控制室溫24℃時，大黃酚出峰時間為24.5 min。

3.3 水解用酸與提取劑的選擇

根據我們以往經驗與文獻報道［11-12］，分別考察了鹽酸、硫酸、高氯酸;乙醚-環己烷、乙醚、氯仿，最后確定用高氯酸水解，氯仿提取2次，大黃酚的測定不受血清干擾，且回收率較好。

3.4 我們曾用大黃生藥、單味大黃提取物給大鼠灌胃，1 h后采血，經同法提取測定，結果大黃生藥體內血藥濃度遠遠低于大黃提取物，說明大黃提取物更利于體內吸收。

3.5 測定復方制劑血藥濃度的意義

中藥復方由若干味中藥組成，每味中藥又含有多種成分，多數中藥或復方現行質量標準中“指標性成分”多為主要藥物的主要成分或可檢測成分，并無充分依據證明其為有效成分。由于藥物在吸收等環節的相互作用，只有被吸收入血的成分才具有成為有效成分的可能。本研究證實復方中大黃的幾個蒽醌類主要成分被吸收入血，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的血藥濃度較高，所建立的方法適用于血中大黃酚的定量測定，復方灌胃后約1 h，血中大黃酚的濃度達到峰值。大承氣顆粒有一重要的作用環節即縮小腸道細菌庫及內毒素池和保護腸屏障，雖然目前沒有報道大黃酚在這方面的藥理作用，但本研究對確定其藥效物質基礎有一定的意義。

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