LC-MS/MS技術同時測定滋心陰口服液中6種化學成分

喬 湜， 石 蕊， 蔣午峻， 盧樹杰， 王 巧*， 張蘭桐

(1.河北醫科大學藥學院藥物分析教研室，河北石家莊 050017;2.河北省中藥注射劑工程技術研究中心，河北石家莊 051430)

滋心陰口服液是由北沙參、赤芍、麥冬、三七四味中藥加工而成的一種中藥復方制劑［1］，具有滋養心陰、活血止痛之功效［2-3］。有關其質量控制的報道主要集中在芍藥苷單一成分的高效液相色譜法(HPLC)測定［4-5］。《中國藥典》(2010 版)也僅對滋心陰口服液中芍藥苷進行了HPLC法含量測定，且樣品的前處理較繁瑣。液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS)［6-8］具有專屬、快速、靈敏等優點，是混合物中化學成分定性和定量分析的有力工具。本研究即采用HPLC-MS法對滋心陰口服液中芍藥苷、芍藥內酯苷2種苷類成分和花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內酯、佛手柑內酯4種香豆素類成分進行了含量測定，以期為其質量控制提供新方法。

1 儀器與試劑

3200Q-Trap質譜儀(美國AB公司)，配有三重四級桿線性離子阱質量分析器和Toubo V電噴霧離子源;Agilent1200液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有四元梯度洗脫泵，自動進樣器和在線脫氣機;Analyst 1.4.2分析軟件(美國應用生物系統公司);BP211D型電子分析天平(德國 Satrorius公司);LG16-B型離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)。

甲醇(色譜純，美國迪馬公司);甲酸(色譜純，美國迪馬公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限責任公司)。

對照品芍藥苷(批號:110736-200629)和補骨脂素(批號:110739-200613)，均購自中國藥品生物制品檢定所;芍藥內酯苷(深圳市美荷生物科技有限公司，含量大于98%)，花椒毒素、異茴芹內酯和佛手柑內酯(上海同田生物技術有限公司，含量大于98%);滋心陰口服液(湖北福人金身藥業有限公司，批號:20090401041，20090804141，20091003118，20100102111)。

2 方法與結果

2.1 色譜和質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18column(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇(A)和0.1‰甲酸-水(B)，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～4 min，40% ～95%A;4 ～7 min，保持 95%A不變;7～7.5 min，95% ～40%A。柱溫:室溫，流速:0.8 mL/min，進樣量:10 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源:電噴霧離子(ESI)源;檢測方式:多反應監測(MRM)模式;采用正負離子同時監測，0～5 min采用負離子模式，用于芍藥內酯和芍藥苷的測定，5～7.5 min采用正離子模式，用于花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內酯和佛手柑內酯的測定;源噴射電壓:5 500/－4 500 V;源溫度(TEM):650℃;簾氣(CUR):20 psi;霧化氣(gas 1):60 psi，加熱氣(gas 2):65 psi，均為氮氣。6種被測成分監測離子對、解簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)見表1，二級質譜圖見圖1。

表1 滋心陰口服液中6種化學成分的保留時間、監測離子與主要質譜參數Table 1 The retention time(tR)，MS/MS fragment ions and main mass parameters of the 6 analytes in Zixinyin Oral Liquid

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 精密量取滋心陰口服液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)至刻度，搖勻。離心(轉速10 000 r/min)10 min，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取對照品芍藥內酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內酯和佛手柑內酯適量，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，得貯備液。精密量取上述各貯備液適量于10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)稀釋至刻度，搖勻，即得芍藥內酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內酯和佛手柑內酯的混合對照品溶液，濃度分別為 64.410，993.680，1.800，0.570，0.625 μg/mL 和 0.366 μg/mL。

圖1 對照品二級離子掃描質譜圖A.芍藥內酯苷 B.芍藥苷 C.花椒毒素 D.補骨脂素 E.異茴芹內酯 F.佛手柑內酯Fig.1 Product ion scan spectra of the standardsA.albiflorin B.paeoniflorin C.xanthotoxin D.psoralen E.isopimpinellin F.bergapten

2.2.3 陰性對照溶液 芍藥內酯苷和芍藥苷，花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內酯和佛手柑內酯分別來源于赤芍和北沙參藥材，按照處方比例及工藝，分別制備缺少赤芍和北沙參藥材的陰性對照樣品，并按2.2.1項下供試品溶液制備方法制備各陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗 取各陰性對照溶液和供試品溶液，按2.1項下色譜和質譜條件進行分析，由HPLC色譜圖(見圖2)可知，兩種陰性對照溶液中均未檢測到干擾成分，表明方法專屬性良好。

2.4 標準曲線、檢測限和定量限 精密量取混合對照品溶液2.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)稀釋至刻度，濃度分別為:芍藥內酯苷16.102 μg/mL，芍藥苷 248.420 μg/mL，花椒毒素 0.450 μg/mL，補骨脂素0.143 μg/mL，異茴芹內酯 0.156 μg/mL和佛手柑內酯0.092 μg/mL，依次逐級稀釋2倍，定容，制得6個濃度梯度的系列標準溶液，按2.1項下色譜和質譜條件進行分析，記錄峰面積。以對照品濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線并進行一元線性回歸，得標準曲線方程(見表2)。將混合對照品溶液逐步稀釋，分別以信噪比S/N=10和S/N=3時各對照品的量作為定量限和檢測限，結果見表2。

表2 滋心陰口服液中6種化學成分的標準曲線方程、檢測限和定量限Tab.2 Linear regression data，LODs and LOQs of the six analytes in Zixinyin Oral Liquid

2.5 儀器重復性試驗 取混合標準溶液，濃度分別為:芍藥內酯苷 4.026 μg/mL，芍藥苷 62.105 μg/mL，花椒毒素 0.113 μg/mL，補骨脂素 0.036 μg/mL，異茴芹內酯0.039 μg/mL和佛手柑內酯0.023 μg/mL，按2.1項下色譜和質譜條件重復進樣6次，記錄6種成分的峰面積，得RSD值分別為0.21%、0.33%、0.49%、0.22%、0.34%和0.57%。

2.6 精密度試驗 取同一批滋心陰口服液，制備供試品溶液6份，分別測定，芍藥內酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內酯和佛手柑內酯6次測定結果的RSD值分別為1.4%、1.1%、1.8%、1.1%、1.3%和3.0%。

2.7 回收率試驗 精密量取同一批滋心陰口服液1 mL共6份，分別置10 mL量瓶中，精密加入混合對照品溶液適量，用甲醇-水(40∶60)稀釋至刻度。按2.2.1項下操作，制備供試品溶液，測定6種化合物的峰面積，計算回收率。測定結果見表3。

表3 回收率測定結果(n=6)Tab.3 The method recoveries for six analytes(n=6)

2.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12 h 時進行測定，芍藥內酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內酯和佛手柑內酯峰面積的RSD值分別為1.2%、1.3%、0.60%、0.50%、1.1%和0.70%，表明供試品室溫放置12 h內穩定。

2.9 樣品測定 取4批滋心陰口服液，制備供試品溶液，進行分析，根據標準曲線計算6種成分的含 量，結果見表4。

表4 滋心陰口服液中6種化學成分含量測定結果(n=3)Tab.4 The contents of six analytes in Zixinyin Oral Liquid samples(n=3)

3 討論

一級全掃描質譜圖中發現，芍藥苷和芍藥內酯苷在負離子檢測模式下分別易產生加合離子峰［M+HCOO］－和準分子離子峰［M －H］－，而花椒毒素、佛手柑內酯、異茴芹內酯和補骨脂素在正離子模式下易產生準分子離子峰［M+H］+。本實驗采用正負離子同時檢測，既保證了檢測的靈敏度和穩定性，又提高了工作效率。

分別考察了流動相中加入3種不同的電解質甲酸、乙酸以及醋酸銨對化合物響應值的影響，發現加入甲酸后響應值和峰形優于乙酸和醋酸銨。對甲酸的比例進一步考察，發現0.1‰甲酸能夠達到最佳的分離效果和穩定的響應值，故以甲醇和0.1‰甲酸水作為流動相梯度洗脫，6種被分析物在7.5 min內全部出峰，而且不受其他化合物的干擾。

滋心陰口服液中北沙參具有滋陰功效，赤芍具有活血功效。因此，本實驗選擇北沙參中的花椒毒素、佛手柑內酯、異茴芹內酯和補骨脂素以及赤芍中的芍藥苷和芍藥內酯苷作為定量指標。對北沙參的成分歐前胡素和異歐前胡素也進行了監測，但未檢測到該兩種物質，推測可能與滋心陰口服液的制備工藝有關。

目前，HPLC-UV法［9-11］常用于中藥及其制劑的質量控制，然而對于這一復雜體系的分析，采用HPLC-MS法則表現出更多的優越性。HPLC-MS法不要求被測成分完全分離，且具有更高的專屬性和靈敏度。本實驗中花椒毒素和補骨脂素的保留時間相同，但因MRM掃描模式監測的離子對不同(分別為217.1/202.1和187.2/131.1)，即可使兩種成分在同時洗脫的情況下分別準確定量，避免了繁瑣的色譜分離條件考察過程，且分析時間也明顯縮短，本實驗中每個樣品的分析時間僅為7.5 min。

本研究采用HPLC-MS方法對滋心陰口服液中6種成分進行了同時測定，方法快速、準確，為滋心陰口服液的質量控制提供了新手段，同時HPLC-MS的應用，也為專屬、有效的中藥現代質量控制體系的建立提供了一個可行的方向。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:1177-1178.

［2］曹 蓓.滋心陰口服液臨床應用舉隅［J］.中國中醫急癥，2001，10(3):170-171.

［3］李素云，孫 磊.補心氣滋心陰口服液治療肺心病急性發作期氣陰兩虛型臨床療效觀察［J］.時珍國醫國藥，1999，10(5):361.

［4］蕭雪梅，黃堅彤.高效液相色譜法測定滋心陰口服液中芍藥甙的含量［J］.實用醫學雜志，2000，16(5):424-425.

［5］王曉敏，尹 清.高效液相色譜法測定滋心陰口服液中芍藥苷的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2001，12(1):46-47.

［6］許玲玲，安 睿，王新宏.液質聯用技術在中藥分析中的應用［J］.中成藥，2006，28(2):239-246.

［7］金 英.液質聯用技術在藥物分析中的應用［J］.河北化工，2009，32(8):67-68.

［8］劉福艷，劉福強，謝元超，等.液質聯用技術在藥物分析中的應用研究進展［J］.中國藥品標準，2008，9(6):443-446.

［9］馬麗麗，董振敏，魯 櫻，等.HPLC法同時測定杞蓉片中五味子醇甲、歐前胡素和蛇床子素的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(7):1111-1114.

［10］劉發榮.高效液相色譜法測定降壓膠囊中芍藥苷的含量［J］.時珍國醫國藥，2002，13(12):728-729.

［11］王錦軍，張秀梅，王宏林.反相高效液相色譜法同時測定車前草中槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的含量［J］.中成藥，2009，31(5):772-775.