壯藥土垅大白蟻菌圃多糖的分析研究

蘇 青， 黃瑞松， 劉 婧

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西南寧 530001)

土垅大白蟻菌圃系昆蟲綱動物土垅大白蟻Macrotermes annandalei(Silvestri)的干燥菌圃。又稱白蟻巢，為常用壯藥材，壯語名稱Rongzmoedhau(容門豪)，具通調(diào)氣道，補肺溫腎，止咳平喘等功效［1］。其含氨基酸，酚性等化學(xué)成分［2-3］。現(xiàn)代藥學(xué)實驗證明:本品水提物具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗炎、鎮(zhèn)痛、提高免疫力功能及抗衰老等生物活性［4-9］。以本品為主藥的處方已成功被研制成民族藥制劑“固本止咳膏”［10］。近年研究又證實了本品多糖具有提高機體免疫功能的活性作用［11］。為進一步闡明本品多糖的化學(xué)構(gòu)效及其內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗對其所含多糖進行定性定量分析研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2401PC可見紫外分光光度計(日本島津公司)，YOKO-ZS紫外分析攝影儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司)，1/105電子分析天平XS205BDU(瑞士梅特勒公司)、As7240BT超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);YOKO-XR顯色加熱器(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司)等。

1.2 試藥試劑 高效硅膠G板(青島海洋化工有限公司)、D-葡萄糖(中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑有限公司)、D-半乳糖(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、D-木糖(中國惠興生化試劑有限公司);試驗所用試劑均為分析純;實驗室用水為蒸餾水。

1.3 材料 土垅大白蟻菌圃:共采集13個不同產(chǎn)地的樣品，其中南寧市郊4的樣品分別為同一窩蟻巢在不同時間采集了6份樣品。其螞蟻兵蟻經(jīng)廣西大學(xué)動物科技學(xué)院潘紅平副教授鑒定，為土垅大白蟻Macrotermes annandalei(Silvestri)，各批樣品采集地點和時間詳見表1、2;土垅大白蟻菌圃多糖:自制，制法詳見“2.1土垅大白蟻菌圃多糖樣品的制備”項下。

表1 不同產(chǎn)地土垅大白蟻菌圃多糖含量測定結(jié)果

表2 不同采集時間土垅大白蟻菌圃多糖含量測定結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 土垅大白蟻菌圃多糖樣品的制備 稱取1號土垅大白蟻菌圃粗粉(過10目篩)50 g，加水浸泡1 h后，煎煮提取6次(煮至 α-萘酚試驗呈陰性反應(yīng))，每次1 h，每次加水約500 mL，紗布濾過，合并濾液，濾液濃縮至約100 mL后，離心，取上清液以Sevag法去蛋白。濃縮去蛋白的多糖溶液至50 mL，放冷，加入乙醇使溶液乙醇終濃度為80%，冰箱中靜置過夜，離心，取醇沉物，依次以無水乙醇、丙酮洗滌后，于50～60℃干燥，得淺灰色的土垅大白蟻菌圃多糖粉末。依照此法制得上述18個土垅大白蟻菌圃多糖樣品，各批樣品多糖得率在13.0% ～22.0% 之間，詳見表1、2。

2.2 土垅大白蟻菌圃多糖TLC分析

2.2.1 方法 稱取上述18個多糖樣品各約20 mg，分別加6 mol/L的鹽酸11 mL，置沸水浴中回流1 h，取出，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL溶解，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取于105℃干燥至恒重的D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖對照品適量，加水制成每1 mL各含0.1 mg的混合糖溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述12個不同產(chǎn)地和6個不同時間采集(同一窩蟻巢)的供試品溶液各 1 ～2 μL、對照品溶液2 μL，分別點于2 塊高效硅膠G薄層板上(不同產(chǎn)地，不同采集時間各1塊)，以正丁醇-丙酮-水(21∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以苯胺-鄰苯二甲酸試液，于150℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈光(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜圖中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，詳見圖1。

圖1 土垅大白蟻菌圃多糖色譜圖

2.3 土垅大白蟻菌圃多糖含量測定

2.3.1 標準曲線的制備 精密稱取于105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品適量，加水制成0.1 mg/mL的對照品溶液，搖勻，備用。分別精密吸取該對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，供測試用。再精密吸取上述稀釋后的對照品溶液各1.0 mL，加5%苯酚試液1.0 mL，搖勻，迅速加濃硫酸5.0 mL，搖勻，室溫下超聲15 min，取出。以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2010年版一部附錄ⅤA)，于490 nm波長處測定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果葡萄糖對照品在5.0～30.0 μg/mL之間其吸光度和濃度呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為:y=0.020 41х+0.000，R2=0.998 5。

2.3.2 換算因子測定 準確稱取精制多糖(1號)10 mg，加水使之溶解，制成0.01 mg/mL的供試品溶液，搖勻，備用。再精密吸取該溶液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.3.1標準曲線的制備項下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，，根據(jù)標準曲線求出糖含量，然后按下式計算換算因子 f，f=w/(C·D)，w:多糖重(mg)，C:葡萄糖濃度(μg/mL)，D:稀釋因素，得 f=1.08，RSD=1.70%。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，備用。再精密該稀釋溶液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.3.1標準曲線的制備項下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，連續(xù)測定5次，結(jié)果RSD為0.145%，表明儀器的精密度高。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液(1號)1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，備用。再精密吸取該稀釋溶液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.3.1標準曲線的制備項下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，分別于 0、30、60、90、120、180 min 各測定一次吸收度，結(jié)果RSD為0.420%，表明本法顯色后在3 h內(nèi)吸光度穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取1號樣品粉末約0.1 g(n=5)，精密稱定，加水使之溶解，制成0.1 mg/mL的供試品溶液，搖勻，備用。精密吸取該溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，供測試用。再精密吸取該稀釋溶液1.0 mL，置10 mL具塞刻度試管中，按“2.3.1標準曲線的制備項下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，計算得樣品多糖平均含量為14.34%，RSD為0.120%，表明本法重現(xiàn)好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量1號的多糖樣品(多糖含量為14.34%)粉末約0.1 g，精密稱定5份，加水制成0.1 mg/mL的溶液，搖勻，備用。精密吸取該溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，分別準確加入0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加水定容至 10 mL，搖勻，供測試用。再精密吸取上述稀釋溶液各1.0 mL，置10 mL具塞試管中，按“2.3.1標準曲線的制備項下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，依法進行測定。計算其平均回收率為99.98%，RSD為0.738%詳見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.7 土垅大白蟻菌圃多糖測定 取上述18個土垅大白蟻菌圃多糖樣品粉末0.1 g(n=3)，精密稱定，加水使之溶解，制成0.1 mg/mL的溶液，搖勻，備用。分別精密吸取該溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，供測試用。再精密吸取上述稀釋溶液各1.0 mL，置10 mL刻度試管中，按“2.3.1標準曲線的制備項下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，依法測定。根據(jù)回歸方程，按下列計算公式，求得不同產(chǎn)地、不同采集時間土垅大白蟻菌圃粗多糖中多糖含量(以葡萄糖計)在14.34% ～23.91%之間，結(jié)果詳見表1、2。

多糖含量%=CDf/W×100

式中C:供試品溶液的濃度(μg/mL);D:供試品溶液的稀釋因素;f:換算因子;W:供試品重量(μg)。

3 討論

3.1 TLC鑒別中，我們對該藥材13個不同產(chǎn)地和6個(同一窩蟻巢)不同時間采集的多糖樣品的水解產(chǎn)物進行了單糖組分的鑒別。試驗結(jié)果表明，各批樣品多糖的酸水解產(chǎn)物TLC圖譜相似，即在紫外光365 nm波長處均可檢識到3個明顯的黃色熒光斑點，并與對照品 D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖相對應(yīng)。提示本品多糖酸水解產(chǎn)物均含D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖等單糖組分。

3.2 在TLC法的供試液制備中，本試驗進行了多糖酸水解條件的探討。我們比較了在100℃下，以1 mol/L、2 mol/L硫酸水解7 h，6 mol/L鹽酸水解1 h 3種水解方式，結(jié)果除2 mol/L硫酸外，1 mol/L硫酸及6 mol/L鹽酸的酸水解產(chǎn)物均可檢視到單糖的斑點，且表現(xiàn)斑點均一致。故從操作簡易出發(fā)，本試驗采用6 mol/L鹽酸進行酸水解。

3.3 采用苯酚-硫酸比色法對該藥材12個不同產(chǎn)地和6個(同一窩蟻巢)不同時間采集的多糖樣品進行了含量測定。試驗結(jié)果表明，13個不同產(chǎn)地的多糖總含量在14.34% ～23.91%之間，其中廣西靖西縣的白蟻菌圃總多糖含量較高，為23.91%，廣西南寧市郊1的白蟻菌圃總多糖含量較低，為14.34%，各產(chǎn)地樣品多糖含量有一定差異;6個不同時間采集樣品的多糖總含量19.01%～21.70%之間，含量差異不大。提示本品多糖含量隨采集地不同而有差異，采集時間對其影響較小。

3.4 苯酚-硫酸比色法為測定多糖的經(jīng)典方法之一，其顯色的硫酸量、時間、溫度、苯酚濃度等因素均對測定結(jié)果有較大影響［12］。經(jīng)對上述各因素正交試驗考察，我們確定了最佳的顯色條件為:1.0 mL供試液中，加入5%苯酚試液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，室溫下超聲15 min。溶液顯色后3 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 在含量測定中，我們還進行了最大吸收峰的考察:分別取多糖供試品溶液和葡糖對照品溶液，在360～800 nm范圍內(nèi)進行全波段掃描。2種溶液的最大吸收峰均在(490±2)nm;故以490 nm為測定波長。

致謝:廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥劑專業(yè)的實習(xí)生馮曉燕，楊云鴻，覃曉三位同學(xué)參與了本試驗研究工作。

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