HPLC測定山楂葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的含量

趙彩云， 王 強

(1.江蘇省徐州藥品檢驗所，江蘇徐州 221006;2.中國藥科大學，江蘇南京 210009)

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅(Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.)或山楂(C.pinnatifidaBge.)的干燥葉［1］，收載于《中國藥典》2010年版一部。到目前為止，已經從山楂的葉中分離鑒定了50余種化學成分［2］，包括黃酮類、三萜類、原花青素類和有機酸類等。現代藥理實驗表明，山楂葉具有降血脂、改善冠脈流量保護心肌、抑制血小板聚集和清除自由基、抗氧化等作用［3-6］，黃酮類化合物是山楂葉生理活性的主要成分包括牡荊素、牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等。本實驗用HPLC法對山楂葉中黃酮類成分牡荊素鼠李糖苷、牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷進行了含量測定方法學的研究。結果表明該測定方法準確、靈敏、重現性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(Waters 2695泵、Waters 2996PDAD檢測器和Empower色譜工作站)，JL-360超聲波清洗器(上海杰理科技有限公司)，AE240電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品:牡荊素鼠李糖苷(111668-200401)、金絲桃苷(111521-200303)、蘆丁(100080-200306)、牡荊素(111687-200501)均購自中國藥品生物制品檢定所，牡荊素-4″-O-葡萄糖苷(中國藥科大學中藥分析教研室提供，純度為99%);山楂葉(來源見表1)，經王強教授鑒定為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.的葉。

乙腈、四氫呋喃均為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

表1 山楂葉藥材來源Tab.1 Habitats of Hawthorn leaves

2.1 色譜條件

色譜柱:Sepax HP C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:A 為乙腈-四氫呋喃(20∶1)，B 為0.5%甲酸溶液，采用梯度洗脫;0～10 min，A為14% ～17%;10～26 min，A 為17% ～18%;26～28 min，A為18% ～14%;檢測波長:360 nm，流速:1.0 mL/min;柱溫:32℃;進樣量:10 μL。混合對照品和供試品色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷對照品適量，加甲醇溶解配制成濃度分別為 0.662 0、0.997 0、0.042 3、0.097 3、0.095 4 mg/mL的混合溶液，作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液3 mL置10 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粗粉約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察

圖1 混合對照品(A)和供試品溶液(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed referencesubstances(A)and sample solution(B)

精密吸取對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5、6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。按上述色譜條件測定峰面積，以進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得回歸方程分別為Y牡荊素-4″-O-葡萄糖苷=1.28 × 104X+7.91 × 104，r=0.999 6，Y牡荊素鼠李糖苷=1.24 ×106X+1.20 ×105，r=0.999 2，Y牡荊素=1.49 × 104X－ 3.03 × 103，r=0.999 8，Y蘆丁=1.68 × 105X－ 7.43 × 102，r=0.999 8，Y金絲桃苷=2.09 × 104X－ 7.05 × 103，r=0.999 9。結果表明:牡荊素-4″-O-葡萄糖苷在33.10～397.2 μg/mL范圍內，牡荊素鼠李糖苷在49.80～598.2 μg/mL 范圍內，牡荊素在 0.21 ～2.54 μg/mL范圍內;蘆丁在4.86～58.4 μg/mL范圍內;金絲桃苷在4.77～57.2 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL平行測定6次，測得牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積RSD分別為0.99%、0.73%、0.99% 、1.23% 、0.85% 。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定峰面積，測得牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積RSD分別為 0.78%、0.88%、0.83%、0.65%、0.72%。表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品5份，分別按供試品溶液制備方法制備，測定樣品中各成分的含量，牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量RSD分別為0.86%、0.98%、0.76%、0.84%、1.23%。表明方法重現性較好。

2.8 加樣回收率測定

精密稱取已知各成分含量的供試品S1 0.75 g，精密加入一定量的牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷對照品，平行試驗5次，按2.3項下方法制備，測定相應峰面積，計算含量和回收率，結果:牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷平均加樣回收率分別為 99.59%、99.57%、98.70%、99.35%、99.28%;RSD分別為 0.50%、0.96%、1.10%、1.16%、0.88%。見表2～6。

表2 牡荊素-4″-O-葡萄糖苷回收率試驗結果Tab.2 Result of recovery test for vitexin 4″-O-glucoside

表3 牡荊素鼠李糖苷回收率試驗結果Tab.3 Result of recovery test for vitexin rhamnoside

表4 牡荊素回收率試驗結果Tab.4 Result of recovery test for vitexin

2.9 樣品測定

分別取不同采集地的山楂葉，按供試品溶液制備方法，平行制備3份，分別精密吸取混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL，測定，按外標法計算含量，結果見表7。

表5 蘆丁回收率試驗結果Tab.5 Result of recovery test for rutin

表6 金絲桃苷回收率試驗結果Tab.6 Result of recovery test for hyperoside

3 討論

3.1 通過對5個對照品LC-PDAD紫外吸收波長的掃描可知，5 種成分分別在 350、335、360、335、360 nm處有最大吸收，考慮到5個組分要在一個色譜系統中同時檢出又要使樣品中各個成分有較大的響應值，且其他成分對其干擾較少，參閱有關文獻［1，7-9］，選擇360nm作為檢測波長，在該波長處5個組分均有較強吸收，干擾少，且分離效果良好。

3.2 曾試用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸(乙酸)進行不同等度洗脫和梯度實驗，結果表明，在乙腈-甲酸的系統中加入四氫呋喃，既可以使相關峰達到有效分離，又可改善目標化合物的峰拖尾現象。因此選擇乙腈-四氫呋喃-甲酸作為流動相。

表7 樣品含量測定結果(n=3)Tab.7 Analytical results of samples

3.3 《中國藥典》2010年版一部收載了山楂葉，其質控指標成分為總黃酮及金絲桃苷。從結果可以看出金絲桃苷雖為主要活性成分之一，但含量非常低(藥典規定應不少于0.050%)。研究表明:牡荊素鼠李糖苷具有擴張血管、保護損傷的心肌組織等作用［10］，與山楂葉的功效作用相一致，因此，僅選擇金絲桃苷作為質控指標值得商榷，而牡荊素4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷為山楂葉中重要的藥理活性成分，含量較高，且為專屬性成分，更適宜作為山楂葉的質控指標。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:30.

［2］陳四平，臧亞茹.山楂葉的研究進展［J］.承德醫學院學報，2003，20(2):164-165.

［3］張文潔，楊 英，張 輝.山楂葉提取物對高血脂大鼠的影響［J］. 遼寧中醫雜志，2008，35(2):307-308.

［4］葉希韻，張 隆，張 靜，等.山楂葉總黃酮對乳鼠心肌細胞